论文发表 | 在肺纤维化领域的重要新发现，被杂志审稿人评价可以“move the field forward”

文献信息

近日，广州医科大学呼吸疾病国家重点实验室苏金教授课题组在肺纤维化领域有重要新发现，相关研究成果以“Intracellular Hydroxyproline Imprinting Following Resolution of Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis”为题发表在 Eur Respir J（IF=16.67）。该研究论文的第一作者为贵州医科大学宋盛仁博士和广州医科大学呼吸疾病国家重点实验室的傅振利博士等，通讯作者为苏金教授和钟南山院士。

该研究借助多种新技术方法，揭示了肺纤维化经典动物模型存在“胞内羟脯氨酸印记”现象，不仅平息了该领域关于动物模型长达20年的争议，还为肺纤维化严重程度评价提供了多维度技术手段，被杂志审稿人评价可以“move the field forward”。

文献背景：

1、特发性肺纤维化现状

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）的特征是异常的伤口愈合反应，导致肺内细胞外基质(ECM)过度沉积，从而导致劳力性呼吸困难、慢性咳嗽、肺功能下降和生活质量受损等症状。肺纤维化疾病的全球致死率高，药物研发失败率高，在过去10年，145项针对肺纤维化的药物研发仅有2项[1]。IPF的五年存活率仅为25%，确诊患者中位生存期仅为3-5年，因此被称为“不是癌症的癌症”[2]。到目前为止，尽管吡非尼酮和尼达尼布这两种药物都减缓了疾病的进展，但它们不能治愈IPF，并且需要增加新的治疗方法来提高患者的生存率。

2、肺纤维化临床前模型的未来前进方向

由于IPF具有与年龄相关的特发性和高度复杂的基础病理生物学特性，因此从整体上来说，其临床前动物建模本身具有一定的挑战性。迄今为止，没有任何一种动物模型能够完全概括人类IPF病程发展的所有方面。但无论选择哪种临床前模型，都需要对肺纤维化进行准确的分析。纤维化终点评估包括胶原蛋白含量的生化定量分析（羟脯氨酸分析），纤维化分布的组织学评估以及其他参数，例如基因表达、肺功能以及放射成像等。

为什么大量的IPF临床药物试验都未能取得成功，在动物模型中有效的药物中，90%在临床上被证明无效。目前肺纤维化在临床上主要依据高分辨率CT（HRCT）扫描和肺活检确诊，越来越多的临床前模型研究建议采用临床肺纤维化的评估方法，减少药物在临床前与临床研究的结果差异。博来霉素是诱导动物肺纤维化的常用药物。ATS研讨会报告提出，气管内博来霉素滴注模型是可用于临床前测试最典型的动物模型[3]，尽管由博来霉素模型诱导肺纤维化的组织病理学模式与普通型间质性肺炎（UIP）并不完全一致。广州医科大学呼吸疾病国家重点实验室肺纤维化学组将micro-CT（设备型号：SNC-100，平生医疗科技（昆山）有限公司）影像学技术结合多种技术手段平息了以往20年肺纤维化研究领域关于小鼠肺纤维化自愈与否的争论，揭示了纤维化自愈的分子机制，同时为抗纤维化药效学评价提供了重要方法学。在肺纤维化动物模型及评价方法中，羟脯氨酸含量测定是肺纤维化程度评价的 “金标准”[3]。但羟脯氨酸含量不仅无法避免动物个体差异所致结果偏差，还无法判断纤维化主要指标胶原的存在状态。因此，肺纤维化动物模型还有待进一步提高和优化其评估的手段。

肺纤维化动物模型通常采用终点测量方法如胶原含量、组织学Ashcroft评分[4]、基因表达、组织学、肺功能等生化评估来评估肺纤维化程度和药物疗效。尽管这些终点测量提供肺纤维化水平有价值的评价结果，但它们不能提供肺纤维化的全貌信息。目前大多数肺纤维化研究很少测量相关的功能指标，如肺功能下降或气体交换受损，而这些变化是 IPF 临床上的重要标志，部分原因是很难在小鼠中稳定地测量这种变化。

为了评估治疗方案中干预措施的真正作用，作者需要知道在给药时是否、何时以及有多少纤维化和炎症存在，因此只能通过使用非侵入性技术，如微计算机断层扫描 (μCT) 成像实现。高分辨率 micro-CT 成像可用于动态和无创地用于动物模型的诊断和监测肺纤维化状态，是研究和量化肺纤维化等肺部疾病负担的一项特别出色的技术，它可确立其对标准终点评估（如组织学和羟脯氨酸分析）的非侵入性附加信息。Micro-CT能够单独纵向可视化和量化每只动物的炎症和纤维化过程，从而确定治疗何干预的窗口。因此，肺纤维化临床前研究应建议从放射成像入手，在活体内观测药物干预对肺纤维化的影响。肺纤维化发病过程中大量的成纤维细胞聚集和分泌ECM，使肺泡腔及肺间质结构在放射成像上与含空气的正常肺泡有显著的差异，基于这一特点，micro-CT的后续影像分析为作者了解临床前动物模型的肺泡通气含量情况，或进一步分析肺纤维化正常通气、通气不良和不通气的肺内情况提供了更直观和准确的数据。因此可作为作者整体评估肺纤维化动物模型的优先选择标准。

实验方法：

使用雄性C57BL/6J小鼠（6-8周）。博来霉素溶解于无菌0.9%生理盐水中，每只动物气管滴注2.0mg/kg.对照组滴注生理盐水。将小鼠随机分为七个体重匹配的实验组：（1）博莱霉素，第1周；（2） 博莱霉素，第2周；（3） 博莱霉素，第3周；（4） 博莱霉素，第4周；（5） 博莱霉素，第10周；（6） 博莱霉素，第16周；（7）生理盐水。为了描述博莱霉素诱导的肺纤维化的时间过程，第（6）组小鼠在博莱霉素滴注前和滴注博莱霉素后第1、2、3、4、7、10、12和16周，使用显微计算机断层扫描（micro-CT）分析（平生医疗科技（昆山）有限公司，设备型号：SNC-100，中国）获取连续动态CT图像。

用异氟醚麻醉小鼠，使用 Super Nova CT（平生医疗科技（昆山）有限公司，型号：SNC-100）获取的，并使用Avatar软件分析（中国平生医疗科技（昆山）有限公司）进行分析。对轴位和冠状位图像进行分析，以确定相同的体内体征（如右支气管分叉），这些体征被定义为纤维化区域。

实验结果：

肺部的显微CT图像。在博莱霉素给药后不同时间点获取轴向（上排）和相应冠状（下排）显微CT图像，剂量为2.0毫克/千克。在每个时间点，用红方标记小鼠右支气管的分叉，以确保在所有CT图像中选择相同位置的区域.

肺通气的定量CT容积评估。a） 第4周博莱霉素治疗小鼠肺部CT图像的代表性彩色图。蓝色：正常充气区域；黄褐色：通气不良的区域；红色：非充气区域。b） 博莱霉素损伤后指定时间点代表性小鼠肺CT充气容积的动态百分比。c） 肺CT充气量的统计计算。

总结：

通过评估肺纤维化动物模型中的生化定量和临床相关 CT 和肺功能衍生定量来弥合临床前和临床研究之间的差距，将对确定治疗靶点和化合物的研究效率产生关键影响。放射影像技术以及更多的临床相关性为研究人员提供了纵向检查单个动物肺纤维化进展的机会，而不必牺牲许多动物来检查纤维化。这些方法的应用更好地模拟了评估临床前肺纤维化模型的临床相关终点指标，可能意味着新的治疗方法更多地能够从体内模型走向临床转化，为肺纤维化的患者治疗带来新的希望。

参考文献：

[1]   KOLB P, UPAGUPTA C, VIERHOUT M, et al. The importance of interventional timing in the bleomycin model of pulmonary fibrosis [J]. The European respiratory journal, 2020, 55(6):

[2]   MIKOLASCH T A, GARTHWAITE H S, PORTER J C. Update in diagnosis and management of interstitial lung disease  [J]. Clin Med (Lond), 2017, 17(2): 146-53.

[3]   JENKINS R G, MOORE B B, CHAMBERS R C, et al. An Official American Thoracic Society Workshop Report: Use of Animal Models for the Preclinical Assessment of Potential Therapies for Pulmonary Fibrosis [J]. American journal of respiratory cell and molecular biology, 2017, 56(5): 667-79.