论文发表 | 黄路生院士团队的研究成果“BMPR-IB基因的缺失导致猪严重肢体畸形”

近日，江西农业大学猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室黄路生院士团队的研究成果“BMPR-IB gene disruption causes severe limb deformities in pigs（BMPR-IB基因的缺失导致猪严重肢体畸形）”在ZOOLOGICAL RESEARCH（中科院1区top期刊，IF：4.560）上发表。平生公司的离活一体Micro CT（型号：NEMO）在论文中提供了重要的猪四肢骨骼图像和定量分析。

该研究的通讯作者为幸宇云教授，第一作者为杨强博士和乔传民博士。

本文摘要

在之前的研究中，研究者们原本计划通过CRISPR/Cas9编辑技术在猪的BMPR-IB基因中产生g.A746G的突变，然而却意外地获得了BMPR-IB纯合敲除仔猪（BMPR-IB^-/-）和携带A746G突变的杂合子敲除仔猪（BMPR-IB^-/746G）。PCR检测及测序结果显示BMPR-IB基因区域中发生了复杂的基因组重排。所有BMPR-IB^-/-和BMPR-IB^-/746G仔猪都无法正常站立和行走。解剖学观察发现，这些仔猪均呈现出严重的四肢骨骼发育异常，其中前肢的前臂骨（尺骨、桡骨）扭曲及截短，腕骨、掌骨和指骨排列紊乱；相比前肢，后肢表现出更严重的畸形，包括腓侧半肢畸形、跗骨增大和脚趾关节骨排列紊乱。与BMPR-IB^-/746G个体相比，BMPR-IB^-/-仔猪的四肢骨骼畸形更为严重。通过蛋白质组学分析，在杂合子敲除仔猪（BMPR-IB^-/746G）和对照组仔猪（WT）的后肢腓骨中鉴别到139个差异表达蛋白（DEPs），大多数DEPs是已知的参与骨骼或胚胎发育、TGF-β通路或肿瘤进展的重要因子；基因本体（GO）和蛋白质结构域富集分析也显示出这些通路上的变化。在排列前50的DEPs中，有一大部分蛋白如C1QA、MYO1H、SRSF1、P3H1、GJA1、TCOF1、RBM10、SPP2、MMP13及PHAX，均已被证明与骨骼发育显著相关。该研究为解析BMPR-IB在哺乳动物肢体发育中的作用提供了新的认识。

实验过程

实验动物

使用200 U/mL IV型胶原酶从1月龄大白猪胎儿中分离PFFs。代孕母猪按照标准流程进行单栏饲养。所有动物手术均在麻醉下进行的，以最大限度地减少痛苦。本研究选用16头3 ~ 5日龄克隆仔猪开展相关试验，其中肢体畸形9头，正常7头。

实验方法

1头BMPR-IB^-/-、2头BMPR-IB^-/746G和2头野生型(WT)克隆仔猪用于骨骼表型分析。作者使用荷兰飞利浦公司生产的双板直接数字化成像系统(Digital Diagnost System,简称DR)拍摄克隆仔猪全身骨骼的x光照片。作者进一步分析了BMPR-IB缺失和WT克隆仔猪四肢骨骼的解剖结构。简单地说，用手术刀、剪刀和镊子来剥离和去除四肢的皮肤、肌肉和相关的粘连组织。收集BMPR-IB^-/- (n=1)、BMPR-IB^-/746G (n=2)和WT (n=2) 克隆仔猪的四肢骨骼，置于−80℃保存。采用Micro-CT系统（平生医疗科技有限公司，中国）对每头仔猪前肢和后肢进行分析，扫描所用分辨率为50 μm，电压为90 kV，电流为60 μA。通过测量距前肢桡骨和后肢胫骨生长板远端2mm的2mm截面来评估骨小梁的定量。对于皮质骨，分析前肢桡骨和后肢胫骨中轴以上3mm的部分。基于阈值分割和三维测量，使用Avatar v1.6.5软件(平生医疗科技有限公司，中国)定量分析桡骨和胫骨的骨小梁和皮质骨(BV/TV，分段骨体积与总体积的比值;BS/TV，分割骨表面与总容积的比值; Tb.Sp，骨小梁间的平均距离，采用直接3D方法评估;Tb.N，单位长度骨小梁的平均数量，是骨小梁结构的关键参数；Tb.BMD，骨密度测量，反映以钙含量为代表的骨骼强度;Ct.BMD:皮质骨矿物质密度;Ct.Th为平均皮质厚度;Ct.ar/Tt.ar，皮质面积分数)。

实验结果

克隆仔猪前肢骨骼Micro-CT分析 A: WT、BMPR-IB^-/746G和BMPR-IB^-/-仔猪前肢骨骼的高分辨率Micro-CT扫描。B: 3种基因型仔猪桡骨的3D和2D灰度图像。C:桡骨远端骨小梁和皮质骨定量结果。数据为平均值±SD (WT, n=4;BMPRIB^-/746G, n=4;BMPR-IB^-/-，n = 2)。ns: P>0.05;*: P<0.05;* *: P<0.01。白色标尺，1厘米。BV/TV:骨小梁体积分数;BS/TV，骨小梁表面密度;Tb.Sp,骨小梁间距; Tb.N,骨小梁数目;Tb.BMD，骨小梁矿物质密度;Ct.BMD:皮质骨矿物质密度;Ct.Th,皮质厚度;Ct.ar/Tt.Ar:皮质面积分数。

克隆仔猪后肢骨骼Micro-CT分析 A: WT、BMPR-IB^-/746G和BMPR-IB^-/-仔猪后肢骨骼的高分辨率Micro-CT扫描。B: 3种基因型仔猪胫骨3D和2D灰度图像。C:胫骨远端骨小梁、皮质骨定量结果。数据为平均值±SD (WT, n=4;BMPR-IB^-/746G, n=4;BMPR-IB^-/-，n=2)。ns: P>0.05，*: P<0.05;* *: P<0.01。白色标尺，1厘米。

结论

通过CRISPR-Cas9和SCNT获得的BMPR-IB缺失仔猪表现出行走困难和严重的前肢和后肢发育畸形。BMPR-IB^-/746G和BMPR-IB^-/-仔猪表型相似。研究者们在肢体畸形的BMPR-IB^-/746G仔猪的后肢腓骨中发现139个DEPs，其中大部分参与骨骼和(或)胚胎发育。他们的研究为大型哺乳动物BMPR-IB缺失提供了新的见解。

实验仪器

Micro CT（型号：NEMO）（平生医疗科技）

影像软件：Avatar（平生医疗科技）