文献信息

近日，昆明医科大学附属口腔医院云南口腔医学重点实验室、昆明医科大学附属口腔医院正畸科团队的研究成果“Small extracellular vesicles from dental follicle stem cells provide biochemical cues for periodontal tissue regeneration（牙囊干细胞的细胞外小泡为牙周组织再生提供生化线索 ）在杂志Stem Cell Research & Therapy（IF：6.832 ）上发表。平生公司的离活一体Micro CT（NEMO）在论文中提供了重要的大鼠牙周组织图像。

该研究的共同通讯作者为胡江天、杨禾丰，共同第一作者为马丽娅、饶南荃。

文献摘要

背景：基于干细胞衍生的细胞外小囊泡（SEV）疗法已被探索作为牙周再生干细胞移植疗法的替代方案。牙囊干细胞（DFSCs）在再生医学中具有巨大的应用潜力。然而，目前尚不清楚DFSC衍生的SEV（DFSCs-SEV）是否可用于牙周再生。本研究旨在探讨DFSCs-sEVs能否再生受损的牙周组织及其潜在的机制。

方法：分离鉴定DFSCs-sEVs，并将其与牙周膜干细胞（PDLSCs）共培养。使用EdU分析、CCK-8分析、细胞周期分析、划痕实验、茜素红染色、qRT-PCR和western blot分析，检测DFSCs-sEVs对PDLSCs生物学行为的影响。RNA测序和功能富集分析用于检测DFSCs-sEVs对PDLSCs影响的信号通路。用ERK1/2或p38 MAPK抑制剂预处理PDLSC，以研究ERK1/2和p38 MAPK通路参与的可能性。此外，将DFSCs-sEVs与胶原海绵复合移植到SD大鼠牙周组织缺损处，然后用苏木精-伊红（HE）染色和Micro CT检查牙周组织的病理变化。

结果：PDLSCs可内化DFSCs-sEVs，从而通过EdU分析、CCK-8分析和细胞周期分析促进细胞增殖。DFSCs-SEV显著增强了PDLSC的迁移。DFSCs-sEVs促进PDLSC的成骨分化，显示出深茜素红染色、成骨基因上调（RUNX2，BSP，COL1）和蛋白表达上调（RUNX2，BSP，COL1，ALP）。作者发现DFSCs-sEVs激活了p38 MAPK信号通路。特异性抑制剂（SB202190）对该信号通路的抑制部分削弱了被DFSCs-sEVs增强的增殖能力。DFSCs-sEVs移植后，大鼠牙周损伤区可见新的牙周膜样结构和骨形成。在新形成的牙周膜和缺损区软组织中观察到标记的DFSCs-SEV。

结论：作者的研究表明，DFSCs-sEVs通过促进PDLSC的增殖、迁移和成骨分化，促进牙周组织再生。

实验方法

大鼠牙周缺损模型

本研究共使用72只12周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠。允许动物自由获取水和食物，并将其保存在受控环境中（50%湿度、25°C和12小时的明暗循环）。所有动物随机分为3组：空白组（未治疗，n=24）；胶原蛋白海绵组（CS，n=24）；胶原海绵组负载DFSCs-sEVs（CS-sEVs，n=24）。如前所述，在大鼠第一磨牙的牙周组织上造成牙周缺损（3×2×1 mm）。按照各组对大鼠进行治疗，并在术后2周、4周和8周采集下颌骨样本。

Micro CT分析

收集的样本用4%多聚甲醛固定24小时。接下来，使用Micro CT系统（NEMO，NMC-100，中国昆山平生医疗有限公司）进行采集。使用以下参数扫描下颌下磨牙区域：90 kV电压和60μA电流。重建数据，并使用Avatar 1.5.0软件（PINGSENG Healthcare Inc.）分析缺损区域的骨体积/组织体积（BV/TV）比和小梁厚度（Tb.Th）。

实验结果

Micro CT结果显示，三组移植后2周未见牙周膜样组织和新骨形成，移植后4周可见新骨形成。移植4周后，胶原海绵组形成分散的新骨碎片，而DFSCs-sEVs组观察到弥漫性骨形成，与其他2组相比，DFSCs-sEVs组观察到更密集的新骨形成（图7D）。此外，作者发现DFSC-sEVs组在术后2周的小梁厚度明显高于未治疗组（图7E）。此外，三组移植后2、4、8周，DFSCs-sEVs组牙骨质与新骨之间均有不同程度的牙周膜样组织。间隔4周后，与其他两组相比，DFSCs-sEVs组显示出高度细胞化的牙周组织，细胞垂直于牙骨质和牙槽骨，呈现出最多的愈合迹象，这与Micro CT结果一致。未治疗组和胶原海绵组均有结缔组织形成。然而，没有一种胶原纤维具有条纹，这些条纹是牙周膜的一个显著特征，有序排列并嵌入牙骨质之间，覆盖牙根和牙槽骨窝内壁（图7F）。为了探讨DFSCs-SEV的定位和存活，将PKH26标记的DFSCs-SEV移植到大鼠牙周缺损区。移植2周后，在新形成的牙周膜和缺损区软组织中观察到标记的DFSCs-SEV，而移植4周后观察到标记较少的DFSCs-SEV（图7B，C）。这表明DFSCs-sEVs参与了大鼠缺损牙周组织中新的牙周膜样组织和新骨的形成。

DFSCs-sEVs促进大鼠牙周组织再生。A体内实验设计。B DFSC-SEV的体内定位。细胞核用DAPI（蓝色）染色，DFSC-SEV用PKH26（红色）标记。白色箭头显示DFSCs-SEV。C DFSC-SEV的量化。D具有代表性的显微CT重建图像显示2-8周时不同组的新骨形成。定量微CT评估BV/TV（%）、Tb。Th（毫米）。F牙周再生的组织学评价。CS，胶原海绵；nb，新骨；nPDL，新牙周膜；d：牙本质*p＜0.05,**p<0.01

文献结论

在本研究中，DFSCs-sEVs通过促进PDLSCs的增殖、迁移和成骨分化，促进大鼠缺损牙周组织中新的牙周膜样结构和新骨的形成；这些生理过程可能部分归因于p38 MAPK信号通路的激活。作者的发现为牙周组织再生中无细胞治疗策略的发展提供了实验基础。

使用设备

Micro CT（型号：NEMO）（平生医疗科技）

影像软件：Avatar（平生医疗科技）