客户论文发表 | 卡非佐米调节肿瘤微环境以加强癌症的免疫检查点治疗

文献信息

近日，暨南大学生命科学与技术学院生命与健康工程研究所 广东省高校功能蛋白研究重点实验室和教育部肿瘤分子生物学重点实验室等单位的研究成果“Carfilzomib modulates tumor microenvironment to potentiate immune checkpoint therapy for cancer（卡非佐米调节肿瘤微环境以加强癌症的免疫检查点治疗 ）在杂志EMBO Molecular Medicine（IF：14.260）上发表。平生公司的活体CT（Supernova）在论文中提供了重要的小鼠肺部肿瘤图像。

该研究的通讯作者陈良、周倩，第一作者为周倩、梁锦霞。

一 文献背景

PD-1抑制剂对部分癌症患者的临床疗效令人印象深刻。然而，仍然迫切需要开发有效的增效剂来扩大其临床应用。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是一种M2极化巨噬细胞，可消除或抑制T细胞介导的抗肿瘤反应。将TAM转化为M1巨噬细胞是一种极具吸引力的抗肿瘤治疗策略。在这里，作者进行了高通量筛选，发现卡非佐米能够有效地驱动M2巨噬细胞表达M1细胞因子，吞噬肿瘤细胞，并向T细胞提供抗原。机制上，卡非佐米诱导未折叠蛋白反应（UPR），激活IRE1a以招募TRAF2，激活NF-κB以转录M2巨噬细胞中编码M1标记物的基因。在体内，卡非佐米通过将TAMs重新编程为M1样巨噬细胞有效地重新构建了肿瘤微环境，并在转基因小鼠模型中缩小了原位肺癌。更重要的是，卡非佐米与PD-1抗体协同作用，几乎完全逆转原发性肺癌。鉴于卡非佐米在临床上的安全性，作者的研究表明，卡非佐米与PD-1抑制剂联合治疗实体瘤患者可能会立即得到应用。

二 实验方法

体内肿瘤模型

一个月大的TetO-EGFR T790M/Del19；将CC10rtTA双转基因小鼠（指定为TD小鼠）喂食含多西环素的饮食约12周以诱发肺癌。肺部肿瘤负荷通过MicroCT（Supernova、SNC-100、平生医疗科技有限公司）进行监测。确认后，将携带肺癌的小鼠随机分为两组，分别用卡非佐米（3 mg/kg（iv.）每周三次）和每2天一次的抗小鼠PD1抗体（10 mg/kg（ip.））治疗，）。治疗2周后，再次行CT检查，并与治疗前的标度图进行比较，评价疗效。然后对小鼠实施安乐死。固定肺组织进行病理学分析。同时，研磨肿瘤结节进行流式细胞术分析。

三 实验结果

卡非佐米在欧洲和美国已被批准用于治疗复发和/或难治性多发性骨髓瘤（MM）。鉴于作者对其将M2重新编程为M1样巨噬细胞的能力的观察，作者假设卡非佐米可以重组肿瘤微环境，并有助于缩小实体瘤。因此，作者进一步在耐药EGFR突变体驱动的转基因小鼠原位肺癌模型中测试了卡非佐米缩小肿瘤的能力。作者在早期工作后，用含多西环素（Dox）的饮食喂养TetO-EGFR（T790M/Del19）/CC10-rtTA双转基因小鼠（指定为TD小鼠），并诱发肺腺癌。引人注目的是，计算机断层扫描（CT）显示卡非佐米治疗导致肺部肿瘤显著消退（图5A和B）。用克隆体消耗巨噬细胞显著损害了卡非佐米的肿瘤收缩作用（图5A和B，以及EV4A和B），表明巨噬细胞在介导卡非佐米的治疗效果中发挥了重要作用。病理分析显示，这些溶媒处理的小鼠的细胞核形态高度异质性，细胞核与细胞质的比率，肿瘤细胞沿肺泡排列紊乱，表明这些肺癌的恶性性质。与此形成鲜明对比的是，作者在卡非佐米组的肺中检测到高度的瘤内间隙和较厚的肺泡壁，这表明原来的肿瘤占位区域发生了剧烈的重塑。此外，卡非佐米治疗的小鼠的核形态异质性和核与细胞质的比率明显较轻（图5C），病理学证实了卡非佐米的治疗效果。引人注目的是，在卡非佐米和克隆体联合治疗的小鼠中，这些作用受到严重损害（图5C和D）。Ki67染色一致显示，克隆体联合治疗削弱了卡非佐米的肿瘤生长抑制作用（图5C和D）。

作者进一步研究了卡非佐米对体内TAMs的影响，发现卡非佐米治疗使TAMs表达更高水平的CD80，而不是CD86（图5E和F以及EV4C）。重要的是，卡非佐米治疗降低了TME中TAM上CD206的表达（图5E和F）。综上所述，这些结果表明，卡非佐米在体内将TAM重新编程为M1样巨噬细胞。

同时，卡非佐米治疗增加了肿瘤浸润CD8+T细胞的百分比。这些CD8+T细胞被激活，因为它们对CD69表达呈阳性（图5G和H）。值得注意的是，作者观察到肿瘤浸润的CD4+T细胞没有显著差异（图EV4D）。为了进一步证实巨噬细胞介导了卡非佐米对突变型EGFR驱动的肺癌的治疗作用，作者用CD11B-DTR转基因小鼠的骨髓重建了致死性照射TD小鼠的免疫系统，然后用含Dox的饮食喂养这些免疫替代小鼠，诱导其发生原发性肺癌。白喉毒素（DT）处理可有效清除这些小鼠体内的巨噬细胞（图EV4E）。用DT处理小鼠后，很大程度上消除了卡非佐米对TD小鼠肺癌的治疗作用（图5I和J）。

图5

A：巨噬细胞在通过卡非佐米介导肺癌萎缩中发挥作用。用多西环素饲养TetO-EGFR（T790M/Del19/CC10-rtTA（TD）小鼠3个月以诱导肺癌。然后在治疗前通过计算机断层扫描（CT）成像记录肿瘤负荷。在用生理盐水（iv.）、克隆体（iv.）、卡非佐米（iv.）或卡非佐米加克隆体治疗2周后，再次对小鼠进行CT扫描（PstRx）。通过ImagJ分析比较PreRx和PstRx的肿瘤面积来确定治疗效果。

I：通过CD11B-DTR小鼠骨髓的免疫重建，对巨噬细胞在介导卡非佐米的肿瘤缩小效应中所起作用的基因确认。用X射线照射TD小鼠（8Gy，20min），并移植来自CD11B-DTR小鼠的5×106个骨髓。通过多西环素饮食诱导免疫替代小鼠发生肺癌。小鼠用生理盐水（iv.）、DT（ip.）治疗2周，卡非佐米（iv.），或卡非佐米加DT。治疗前后通过CT成像记录肿瘤负荷。

作为专业的抗原呈递细胞，巨噬细胞积极参与培养T细胞的抗肿瘤免疫。作者发现，在RAG1-/-不产生功能性T细胞的小鼠（图6A-C），表明T细胞在这种环境中起关键作用。为了进一步证实这一结果，作者使用抗体删除TD肺癌转基因小鼠中的CD8+（图EV5A-C）或CD4+（图EV5D和E）T细胞，并发现在删除任一群体后，卡非佐米的治疗效果显著受损（图6D和E，以及EV5F和G）。

PD-1抑制剂已广泛用于增强T细胞的功能以治疗癌症患者。然而，PD-1抗体未能使大部分癌症患者受益。例如，驱动因素突变阳性肺癌患者对PD-1抗体治疗没有反应。然后，作者在TD小鼠上测试了PD-1抗体和卡非佐米的联合治疗。与早期报告一致，PD-1抗体单峰治疗对这些EGFR突变型肺癌没有明显的治疗效果（图6F和G）。引人注目的是，作者发现卡非佐米与PD-1抗体协同治疗TD小鼠中几乎完全消退（CR）的肺癌（图6F和G，以及EV5H和I）。作者还发现，用卡非佐米和PD-1抗体联合治疗可更有效地激活CD8 T+细胞（图6H和I）

D：CD4+和CD8+T细胞在介导Carfilzomib的抑癌作用中发挥作用。用生理盐水、卡非佐米、抗小鼠CD4抗体（ip）治疗荷肺癌TD小鼠，抗小鼠CD8抗体（ip），或卡非佐米加抗小鼠CD4/8抗体。治疗2周后进行CT扫描。

F：卡非佐米与PD1抗体协同治疗肺癌。用生理盐水、抗PD1抗体（ip）、卡非佐米或卡非佐米加抗PD1（ip）治疗患有肺癌的TD小鼠。治疗2周后进行CT扫描。

四 文献结论

以PD-1抑制剂为例的免疫疗法在各种晚期癌症中产生了前所未有的疗效和持久的反应。不幸的是，很大一部分患者对这种治疗没有反应。临床上迫切需要开发增效剂以扩大PD-1抑制剂的使用。在作者目前的研究中，作者发现卡非佐米和其他蛋白酶体抑制剂在较小程度上将M2重新编程为M1样巨噬细胞，从而使更多的CD8+T细胞浸润并控制体内的肿瘤。作者已经证明，蛋白酶体抑制激活IRE1a以募集TRAF2，并激活NF-jB以转录炎性细胞因子和趋化因子，从而为免疫治疗创造有利的肿瘤微环境。更重要的是，卡非佐米与PD-1抗体协同作用，以缩小突变EGFR引起的肺癌，而突变EGFR对PD-1抗体没有反应。

五 使用设备

Super Nova® Micro CT (平生医疗科技)

影像软件: Avatar（平生医疗科技）