文献信息

近日，昆明医科大学附属口腔医院 云南省口腔医学重点实验室（培育）杨禾丰副教授团队的研究成果“Comparative study of dedifferentiated fat cell and adipose-derived stromal cell sheets for periodontal tissue regeneration: In vivo and in vitro evidence（去分化脂肪细胞和脂肪来源间充质干细胞膜片用于牙周组织再生的比较研究:体内和体外证据）在杂志JOURNAL OF CLINICAL PERIODONTOLOGY（IF:7.478 ）上发表。平生公司的离活一体Micro CT（  型号：NEMO）在论文中提供了重要的大鼠牙周缺损模型图像。
 

该研究的通讯作者为杨禾丰副教授，第一作者为黄国宾、夏斌。

文献摘要

目的:比较脂肪源性去分化脂肪(DFAT)细胞与脂肪间充质干细胞(ADSC)片再生治疗牙周缺损的疗效。

材料与方法:采用天花板贴壁培养法，获取成熟脂肪来源的去分化（DFAT）细胞，通过CCK-8、集落形成实验、表面抗原鉴定、多向诱导分化等比较其与脂肪间充质干细胞（ADSCs）生物学特性的区别；通过膜片诱导培养基进行DFAT细胞及ADSC膜片培养，HE染色、RT-PCR、免疫荧光等方法比较两种细胞膜片的生物学特性；通过Micro CT、组织学染色等比较两种细胞膜片修复大鼠牙周组织缺损的效果。

结果:DFAT细胞和ADSCs具有间充质干细胞的特征。两种细胞分子表面抗原均为CD29-、CD90-和CD146-阳性，而CD31-、CD34-和CD45-阴性。DFAT细胞和ADSCs具有相似的成骨分化能力和成脂分化能力以及集落形成能力。DFAT细胞较ADSCs具有更强的增殖能力。相较ADSC膜片，DFAT细胞膜片成牙周相关基因和蛋白表达能力更强，且具有更强的牙周组织再生能力。

结论:作者的研究结果表明，DFAT细胞膜片可以再生修复牙周组织缺损，能成为一种较为理想的种子细胞来源与运载形式。

实验方法

DFAT细胞和ADSC片修复牙周缺损模型

牙周缺损模型的建立

共72只成年SD大鼠随机分为三组，每组包含24只动物（四个时间点各6只大鼠）。术前禁食6h。大鼠腹膜内注射戊巴比妥钠（3%）用于全身麻醉，剂量为0.1ml/100g。然后固定每只大鼠，并对大鼠右侧的下颌手术区进行消毒。在下颌骨下边缘平行约5mm处形成2cm切口，并将组织逐层分离，以暴露下颌骨的骨表面。用高速手机球钻小心制备3mm×2mm×1mm的缺损区，探针测量缺损范围。牙周膜、牙骨质和表面牙本质可通过手动器械移除。

建立空白对照组（未处理）、DFAT细胞膜片组和ADSC膜片组。生理盐水冲洗缺损区域以去除碎屑后，放置每个实验组的细胞膜片以覆盖缺损区。在空白对照组，不放置膜片在其上。切口用4-0条丝线逐层缝合。在术后7天，对动物连续肌肉内注射青霉素，以防止手术感染。
 

移植后2、4、6和8周，在深度麻醉下处死动物并采集样本。在用4%多聚甲醛固定过夜后，使用微型计算机断层扫描（CT）（NEMO NMC-100，平生医疗科技有限公司）扫描大鼠下颌骨标本，并对获得的图像进行三维重建。分析缺损区域的骨体积/组织体积（BV/TV）、小梁厚度（Tb.Th）和小梁分离度（Tb.Sp）。

实验结果

术后2周，三组均未观察到明显的新骨形成。术后4周，在三个实验组的牙周缺损区域观察到新骨形成。值得注意的是，与空白对照组相比，DFAT细胞膜片和ADSC膜片组的缺损区域愈合更快。

三组牙周缺损区均逐渐愈合。DFAT细胞和ADSC片组在缺损区域形成了密度更高的新骨，并在术后6周和8周表现出更好的修复效果（图4f）。显微CT形态计量参数分析显示，2周后，ADSC膜片组缺损区域的骨体积密度（BV/TV）和小梁骨厚度（Th）显著高于空白对照组（p<0.01）（图4g，h）。术后6周，DFAT膜片组缺损区的骨体积密度（BV/TV）显著高于ADSC膜片组（p<0.01）。DFAT膜片组的小梁骨厚度（Tb.Th）显著高于空白对照组（p<0.01）（图4i）。相反，DFAT膜片组的小梁骨分离（Tb.Sp）显著低于空白对照和ADSC膜片组（p<0.01）（图4h）。术后8周，DFAT膜片缺损区域的骨体积密度（BV/TV）显著高于空白对照组（p<0.01）（图4g），DFAT膜片组和ADSC膜片组的小梁骨分离（Tb.Sp）显著低于空白对照组。这些结果表明，DFAT细胞和ADSC膜片对大鼠牙周组织缺损区域具有修复作用，并促进牙周组织再生。

图4 大鼠牙周组织缺损模型的图示和用于修复牙周骨内缺损的去分化脂肪（DFAT）细胞和脂肪间充质干细胞（ADSC）膜片的显微计算机断层扫描（CT）分析。（a） 大鼠牙周缺损模型示意图。（b，c）大鼠牙周缺损模型的描述。（d） 暴露第一磨牙的远根和颊根（黑色箭头）。（e） 细胞膜片移植（黑色箭头）。（f） 未治疗组、DFAT细胞和ADSC膜片修复牙周骨内缺损的显微CT图像。（g–i）修复牙周骨内缺损的DFAT细胞和ADSC膜片的显微CT形态参数分析结果。n=6，*p<0.05**p<0.01***p<.001

文献结论

基于当前的发现和先前的文献，作者得出结论，DFAT细胞是一种高度均一的细胞群体，具有高增殖能力，在体外和体内具有多系分化的潜力，类似于ADSCs。因此，脂肪组织可以作为储备量大、材料方便的细胞库，获得理想的自体干细胞和去分化脂肪细胞，用于牙周组织工程和再生医学。本研究表明，DFAT细胞是牙周组织工程种子细胞的理想来源和递送形式。

使用设备

Micro CT（型号：NEMO）（平生医疗科技）

影像软件：Avatar（平生医疗科技）