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近日，北京大学医学部基础医学院医学同位素研究中心、北京大学第一医院核医学科等团队的研究成果Noninvasive interrogation of CD8+T cell effector function for monitoring tumor early responses to immunotherapy（CD8+T细胞效应因子功能的无创性探究监测肿瘤对免疫治疗的早期反应）在学术期刊The Journal of Clinical Investigation（影响因子19.456）发表。平生公司的小动物PET/CT（型号：Super Nova）产品在论文中提供了重要的小鼠PET/CT图像和定量分析。

该研究的通讯作者为刘昭飞教授、李囡主任医师、杨兴研究员。第一作者为周昊毅、王琰璞。

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准确识别对免疫治疗有反应的患者在临床上仍然具有挑战性。一种非侵入性的方法，可以纵向捕获有关免疫细胞功能的信息，并协助早期评估肿瘤反应是非常理想的精确免疫治疗。在这里，作者展示了正电子发射断层扫描(PET)成像使用颗粒酶B靶向放射示踪剂，命名为⁶⁸Ga-grazytracer，可以无创和有效地预测多种肿瘤模型中对免疫检查点抑制剂和过继T细胞转移治疗的反应。⁶⁸Ga-grazytracer从多种非醛类肽基示踪剂中筛选而来，具有良好的体内代谢稳定性和对效应CD8+T细胞在免疫反应中分泌颗粒酶B的靶向性。⁶⁸Ga-grazytracer比¹⁸F-FDG更敏感地区分有反应者和无反应者，从而在不同免疫原性的小鼠模型中，通过免疫检查点封锁治疗区分肿瘤的假进展和真进展。在一项有5名患者参与的初步临床试验中，注射⁶⁸Ga-grazytracer后未观察到不良事件，接受免疫治疗的癌症患者的临床反应与⁶⁸Ga-grazytracer PET结果良好相关。这些结果强调了⁶⁸Ga-grazytracer PET在颗粒酶B分泌相关免疫疗法的临床应用方面的潜力，通过支持早期反应评估和以无创伤和纵向的方式精确的患者分层。

实验方法

使用Super Nova PET/CT扫描仪(平生医疗科技有限公司)对小动物PET进行扫描和图像分析。MC38, LLC, 4T1或B16OVA荷瘤小鼠在异氟烷麻醉下给予5.55 MBq ⁶⁸Ga标记的放射性示踪剂或¹⁸F-FDG。为了¹⁸F-FDG成像，MC38和4T1肿瘤小鼠在注射¹⁸F-FDG前禁食6小时。在注射后的指定时间(如0.5、1和2小时)，进行10分钟静态PET扫描。分析PET图像，并按照前面所述计算感兴趣区域(ROI)导出的每克组织注射剂量百分比(%ID/g)值对于假性进展和真性进展的肿瘤模型，MC38和4T1荷瘤小鼠腹腔注射200 μg抗PD-1(克隆RMP1-14)+ 200 μg抗CTLA-4抗体(克隆9D9;在第0、3和6天使用)。在第0天(基线)和第6天，小鼠在注射0.5或1小时后接受⁶⁸Ga-grazytracer或¹⁸F-FDG的小动物PET成像。

实验结果

⁶⁸Ga-grazytracer在抗PD-1预处理的MC38荷瘤小鼠体内的分布。⁶⁸Ga-grazytracer在注射0.5 h后肿瘤摄取最高，随着时间的推移⁶⁸Ga-grazytracer肿瘤摄取下降(图2E)。由于血液中的放射性示踪剂被迅速清除，肿瘤与血液的比值随着时间的推移而增加。注射后1小时肿瘤-肌肉比最高(图2F)。体内生物分布证实了⁶⁸Ga-grazytracer PET在体内的结果(图S6)。为了进一步研究⁶⁸Ga-grazytracer PET的肿瘤摄取值是否确实能反映颗粒酶B在体内的水平，作者对一些荷瘤小鼠进行了⁶⁸Ga-grazytracer PET成像。老鼠PET扫描后立即实施安乐死,granzyme B表达测量肿瘤(图2GH)。

图2 ⁶⁸Ga-grazytracer的体内外表征。(A)免疫治疗后效应T细胞活化和颗粒酶B (GrzmB)分泌示意图。(B) ⁶⁸Ga-grazytracer的化学结构。(C) ⁶⁸Ga-grazytracer与小鼠或人颗粒酶B结合的特异性(n = 5)。(D)注射64Cu-grazytracer 0.5 h后，MC38荷瘤小鼠15 μm厚的肿瘤连续切片的放射自显影(中)和颗粒酶B免疫荧光染色(两张)。这三个连续剖面的覆盖区域用红色虚线表示。规模:1毫米。数据是三个独立实验的代表性数据。(E)注射后0.5、1和2小时，⁶⁸Ga-grazytracer在抗pd -1处理的小鼠体内的代表性PET图像。(F)计算⁶⁸Ga-grazytracer的肿瘤-血液和肿瘤-肌肉比值(n = 5)。(G) ⁶⁸Ga-grazytracer在MC38载瘤小鼠中的小动物PET图像和相应的肿瘤摄取值(16只小鼠接受PET成像，2只因尾静脉注射失败而被排除)。(H)从MC38荷瘤小鼠身上提取的MC38肿瘤颗粒酶B的Western blotting(图G)。通道在同一凝胶上运行，但不连续。(I) PET成像定量⁶⁸Ga-grazytracer肿瘤摄取与体外western blotting测定颗粒酶B/β-微管蛋白比值的相关性(Pearson相关分析r = 0.7168)。(J) PET成像定量的⁶⁸Gagrazytracer肿瘤摄取与ELISA测定的体外颗粒酶B水平之间的相关性(Pearson相关分析r = 0.7337)。PET图像中白色箭头表示肿瘤。所有数值数据均以平均值±标准差表示。**，P <0.01未配对Student t检验(C)。

随后，作者通过靶向效应T细胞在免疫反应中释放的颗粒酶B，测试⁶⁸Ga-grazytracer PET是否可以用于预测动物模型中对ICI的早期肿瘤反应。14只MC38荷瘤小鼠在第0、3、6天使用抗PD-1抗体处理，第9天使用⁶⁸Ga-grazytracer PET(图3A)。在治疗组观察到⁶⁸Ga-grazytracer的可变肿瘤摄取(图3B)。抗PD-1治疗组小鼠按68Ga-grazytracer肿瘤摄取值分为2组(截止值为1.45% ID/g;⁶⁸Ga-grazytracer在对照组中肿瘤摄取值最高):肿瘤摄取≥1.45% ID/g(高摄取组;平均肿瘤摄取= 2.23±0.33;肿瘤摄取范围为1.93 ~ 2.84)，肿瘤摄取< 1.45% ID/g者(低摄取组;平均肿瘤摄取= 1.18±0.19;肿瘤摄取范围:11 0.93 ~ 1.44;图3 b)。监测载药对照组和抗PD-1治疗组的肿瘤生长曲线(图3C)。第9天，高摄取组⁶⁸Ga-grazytracer的肿瘤摄取量显著高于对照组和低摄取组(P <0.0001;图3 d)。

图3 ⁶⁸Ga-grazytracer的小动物PET成像预测MC38荷瘤小鼠对抗PD-1治疗的肿瘤反应。(A)抗PD-1 (αPD-1)治疗时间轴和MC38荷瘤小鼠PET成像。(B)注射后0.5h ⁶⁸Ga-grazytracer在PBS(对照)或抗PD-1处理的MC38荷瘤小鼠体内的代表性PET图像，肿瘤摄取高低(截止值为1.45% ID/g)。白色箭头表示肿瘤。(C)对照组或高、低肿瘤摄取治疗组的MC38荷瘤小鼠的个体肿瘤体积。(D)在第9天注射后0.5 h，每组MC38荷瘤小鼠对⁶⁸Ga-grazytracer的肿瘤摄取定量(n = 7/组)。(E) MC38荷瘤小鼠第9天和第16天的肿瘤体积(n = 7/组)。(F)流式细胞术分析描绘了CD8+ T细胞在CD45+细胞，IFN-γ+或颗粒酶B+ CD8+ T细胞中的比例，以及颗粒酶B水平从小鼠身上提取的治疗后(n = 5-6 /组)。(G, H) MC38荷瘤小鼠在指定处理后的肿瘤生长曲线(G)和体重曲线(H) (n = 6-8 /组)。所有数值数据均以平均值±标准差表示。*, P < 0.05;* *, P < 0.01;* * *, P < 0.001;****，P <0.0001通过单向方差分析和事后Tukey检验(D, E, F)和双向方差分析(G)。

作者在第0天和第6天对两种肿瘤模型进行¹⁸F-FDG和⁶⁸Ga-grazytracer的PET成像。由于肿瘤进展(图4B, C)和糖代谢增加，MC38 (P <0.05)和13 4T1肿瘤(P <0.01)模型中¹⁸F-FDG的肿瘤摄取从第0天到第6天显著增加(图4F-I)。相反，在假性进展的MC38肿瘤模型中，⁶⁸Ga-grazytracer的肿瘤摄取从第0天到第6天显著增加(P <0.01，图4F, G)。然而，在4T1小鼠荷瘤真进展模型中没有观察到⁶⁸Ga-grazytracer的显著摄取(图4H, I)。这些结果表明，⁶⁸Ga-grazytracer PET在ICI治疗第6天检测到MC38肿瘤而不是4T1肿瘤的高颗粒酶B分泌，从而预测早期治疗阶段的肿瘤反应。

图4 ⁶⁸Ga-grazytracer PET在抗pd-1 (αPD-1)和抗ctla -4 (αCTLA-4)治疗的假进展和真进展小鼠模型中成像。(A) MC38或4T1肿瘤模型的免疫治疗和PET成像时间轴。(B, C)治疗后MC38荷瘤小鼠(假性进展)(B)和4T1荷瘤小鼠(真进展)的个体肿瘤生长曲线(C)。(D, E) MC38 (D)和4T1 (E)荷瘤小鼠治疗后体重。(F, G)第0和6天假进展MC38荷瘤小鼠¹⁸F-FDG和⁶⁸Ga-grazytracer的代表性PET图像(F)和定量肿瘤摄取(G) (n = 8-9 /组)。(H, I)真实进展4T1荷瘤小鼠在第0天和第6天(n = 8-9 /组)18F-FDG和⁶⁸Ga-grazytracer的代表性PET图像(H)和定量肿瘤摄取(I)。(J)第0天和第6天收获的MC38或4T1肿瘤组织中颗粒酶B的代表性免疫荧光染色。规模,1毫米。数据是三个独立实验的代表性数据。PET图像中白色箭头表示肿瘤。所有数值数据均以平均值±标准差表示。*, P < 0.05;**， P <0.01 by双尾配对Student t检验(G, I)。

anti-PD-1 + anti-CTLA-4组在添加或不添加FTY720时分别进行¹⁸F-FDG和⁶⁸Ga-grazytracer PET显像。在FTY720处理组和未处理组，¹⁸F-FDG在0 - 6天显示相似的成像模式(图5C, D)。相反，⁶⁸Ga-grazytracer在抗PD-1 +抗CTLA -4治疗后0 - 6天内肿瘤摄取增加。同时，antiPD-1 + anti-CTLA-4和FTY720处理后0 - 6天无显著差异(图5E, F)。

图5 ⁶⁸Ga-grazytracer在免疫细胞浸润抑制或不抑制小鼠模型中的PET成像。(A) MC38荷瘤小鼠PET成像、抗PD -1 (αPD-1) + 抗CTLA-4 (αCTLA-4)联合免疫治疗和FTY720治疗的时间轴。(B) MC38荷瘤小鼠在指定治疗后的肿瘤生长曲线:对照(PBS)、FTY720、αPD-1 + αCTLA-4和αPD-1 + αCTLA-4 + FTY720 (n = 6 - 9/组)(C, D)在αPD-1 + αCTLA-4治疗的MC38荷瘤小鼠(n = 8-9 /组)0和6天18F-FDG的代表性PET图像(C)和肿瘤摄取定量(D)。(E, F) ⁶⁸Ga-grazytracer在αPD-1+αCTLA-4处理的MC38载瘤小鼠(FTY720处理或不处理)第0天和第6天的代表性PET图像(E)和定量肿瘤摄取(F) (n = 8-9 /组)。(G)流式细胞术分析显示，经过指示性治疗的小鼠肿瘤中NK1.1+细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞在CD45+细胞中的比例(n = 5/组)。PET图像中白色箭头表示肿瘤。所有数值数据均以平均值±标准差表示。*, P < 0.05;* *, P < 0.01;****， P <0.0001通过双向方差分析(B)，双尾配对Student t检验(D, F)，和双尾不配对Student t检验(G)。

与第8天相比，对照组第12天肿瘤对⁶⁸Ga-grazytracer的摄取相对没有变化(图6D, E)。同时，经过WT T细胞过继转移的组，部分肿瘤在第12天对⁶⁸Ga-grazytracer的摄取增加;然而，与基线值(第8天;图6 e)。