近日，北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所，核医学科，国家药监局放射性药物研究与评价重点实验室，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，杨志主任团队的研究成果Evaluation of SARS-CoV-2-Neutralizing Nanobody Using Virus Receptor Binding Domain-Administered Model Mice（利用病毒受体结合域给药模型小鼠评价SARS-COV-2中和纳米体）在学术期刊Research（影响因子11.036）发表。平生公司的小动物PET/CT（型号：Super Nova ）在论文中提供了重要的小鼠PET/CT图像和定量分析。

该研究的通讯作者为杨志研究员、朱华研究员、万亚坤教授、韩鸿宾教授。第一作者为刘松。

文献背景

由于2019冠状病毒病(COVID-19)的快速传播，迫切需要开发额外的诊断工具，以进一步分析该疾病。分离到的纳米体Nb11-59与严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)受体结合域(RBD)具有高亲和力，可中和病毒并阻断血管紧张素转换酶2- (ACE2-) RBD的相互作用。在这里，作者介绍了一种新型的基于纳米体的放射性示踪剂⁶⁸Ga-Nb1159。放射示踪剂对RBD保持高亲和力，在体内外均显示出可靠的放射化学特性。临床前正电子发射断层扫描(PET)研究表明，⁶⁸Ga-Nb1159在小鼠体内被快速清除，并被肾脏和泌尿系统摄取。幸运的是，⁶⁸Ga-Nb1159可以特异性地揭示RBD在小鼠体内的分布。本研究也有助于评估中和纳米体的药效学效应。此外，⁶⁸Ga-Nb1159可能是一个有希望的工具来探索RBD的分布和提高对该病毒的认识。特别是，本研究发现了一种新型的分子放射源，并建立了一种可靠的评估方法，可通过无创可视PET技术特异性研究RBD。

实验方法

KM小鼠的临床前PET/CT成像

用异氟烷麻醉(2-3%，1L/min氧气)麻醉KM小鼠，置于加热床上进行临床前PET/CT扫描(Super Nova, 平生医疗科技有限公司)，然后注射⁶⁸Ga-Nb1159 200 μL。动态PET图像采集时间为30分钟(5分钟/帧)。在CT图像上绘制感兴趣区域(ROIs)，并进一步在PET上绘制。采集各脏器的SUVmax，计算其动态曲线。⁶⁸GaNb1159在注射后60min和120min进行静态PET扫描。

此外，假设一个Nb11-59螯合一个放射性核素⁶⁸Ga, ⁶⁸Ga与纳米体Nb11-59的比值为0.02%。补充说明了计算过程。

RBD小鼠模型和临床前PET成像

如方案1(b)所示，为检测纳米体Nb11-59对SARS-CoV-2的特异性，昆明小鼠(雌性，18-20 g)在右肩区PBS (40 μg、20 μg或10 μg)中注射不同剂量的SARS-CoV-2刺突RBD。作为比较，在其他小鼠的相同区域注射0.01 M PBS。将RBD和PBS代谢30分钟，然后静脉注射⁶⁸Ga-Nb1159, 30分钟后使用临床前PET按上述方案进行成像。作为比较，上述小鼠在肩区以40 μg和0 μg剂量注射RBD，并使用最常用的PET试剂¹⁸F-FDG进行评估。然后，比较RBD注射区域和对侧区域的最大标准化摄取值(SUVmax)。

对Nb11-59在体内其他器官对SARS-CoV-2是否具有特异性进行了关键性实验。昆明小鼠(雌性，18 ~ 20 g)气管内接种RBD 300 μg(以100 μL PBS为单位)或0.01 M PBS (100 μL)，麻醉后腹腔注射4%水合氯醛0.2 mL。这种方法在前面中已经描述过。静脉注射⁶⁸Ga-Nb1159 3h;接种后30分钟和60分钟在相同的方案指导下进行临床前PET成像扫描(p.i.)。比较RBD注射与0.01 M PBS注射小鼠肺SUVmax的差异。此外，以每小时60分钟的速度去除含RBD (75 μg)和PBS的肺。然后，对左肺和右肺进行体外临床前PET显像，用伽马计数器进行加权和计数。

实验结果

临床前PET成像研究。对初生KM小鼠的动态PET成像显示，68Ga-Nb1159可迅速从小鼠体内清除，主要聚集在肾脏和膀胱，肝脏摄取较低(图3(c))。虽然肝脏摄取与图3(a)中脾脏和肺的摄取相似，但肝脏密度较脾脏和肺重。因此，在整体PET成像中，脾脏和肺的摄取远低于肝脏(图3(c))。动态SUVmax曲线显示肾脏对示踪剂的摄取较高，其次是肝脏(图3(d))。选择最大单体素标准化摄取值(SUVmax)，标准的核医学度量，通过测量与患者质量和给药活动标准化的感兴趣体积(器官)的最大体素值来显示探针在组织或器官中的积累。PET显像显示68Ga-Nb1159在5 min p.i.时在各器官中积累量最高，随时间增加而减少。此外，SUVmax在20分钟p.i后保持一致。随后，在1小时和2小时p.i时对KM小鼠进行静态PET成像(图S2a)。扫描结果与30分钟动态成像相似。结果显示，肾脏和膀胱中积累了高水平的示踪剂。

图3 ⁶⁸Ga-Nb1159的体内表征。(a) ⁶⁸Ga-Nb1159注射后不同时间点在KM小鼠体内的生物分布(n = 3,20 μCi /只小鼠静脉注射)。(b) ⁶⁸Ga-Nb1159在KM小鼠体内的药代动力学。(c) ⁶⁸GaNb1159在KM小鼠体内30分钟内的动态临床前PET显像。(d)图3(c)动态临床前PET显像初始器官的SUV最大值。

在右肩注射RBD的KM模型小鼠的临床前PET成像显示68Ga-Nb1159在体内表现出对RBD的特异性(图4(e))。该探针可以定位区域，揭示RBD的分布。与对侧区域相比，rbd注射区域的68Ga-Nb1159在影像学(图4(e))和SUVmax(图4(a))方面均显著增加(40 μg、20 μg和10 μg)。随着RBD量的增加，SUVmax不断增加(图4(a))。此外, SUVmax与RBD量呈正相关(图4(d))。这一相关性提示我们应该对治疗性抗体治疗的效果进行一定的评价。此外，成像结果与初始KM小鼠成像结果相似，包括肾脏、膀胱和肝脏的示踪剂摄取高;其他器官的SUVmax如图S1b所示。

图4 RBD治疗小鼠模型的临床前PET成像及分析。(a)图4(e) RBD注射肌肉与对侧肌肉(对照组)的SUVmax比较。(b)图S1c中RBD注射肌肉和对侧肌肉(对照组)静脉注射¹⁸F-FDG后SUVmax的比较(c)图4(f)静脉注射⁶⁸Ga后30分钟和60分钟时肺部SUVmax的比较∗∗p < 0:01，∗∗∗p ＜0.001，∗∗∗∗p＜0.0001(d) SUVmax与RBD量的相关性。(e)皮下注射RBD后给KM小鼠静脉注射⁶⁸Ga-Nb1159的临床前PET成像。白色箭头表示RBD的皮下注射。(f)肺内注射RBD或0.01 M PBS后60分钟静脉注射KM小鼠⁶⁸Ga-Nb1159临床前PET成像。

Nb16-68对SARSCoV-2表现出良好的抑制活性。用黄曲霉毒素B1检测纳米体Nb70作为阴性对照纳米体。中和纳米体Nb11-59和Nb16-68在本实验中被认为是阳性对照治疗纳米体，因为它们能够结合SARSCoV-2 RBD。确定药效学作用⁶⁸Ga-Nb1159与阴性对照纳米体Nb11-59或正常PBS共注射其他与SARS-CoV-2 RBD结合并用于治疗病毒感染的抗体。然后，根据PET图像计算出的SUVmax值揭示了抗体的药效学作用，可用于防止流感大流行的进一步传播。PET图像如图5(a)所示。注射Nb11-59的小鼠右肩(SARS-CoV-2 RBD注射区)摄取减少。在本分析中，较好的治疗效果意味着较低的PET成像SUVmax。Nb11-59共注射组SUVmax均值为0.32。相比之下，共注射阴性纳米体和PBS组的SUVmax分别为0.53和0.51(图5(b))。PET显像显示，PBS组的SUVmax峰值为0.62，与负纳米体组(0.63)相似，超过Nb11-59组(0.45)。此外，当研究者使用该制剂注射不同剂量的Nb11-59时，SUVmax呈现剂量依赖性下降(当Nb11-59分别以0 mg、0.33 mg、0.57 mg和1.20 mg注射时，SUVmax分别为0.29、0.27、0.26和0.18)，如图5(c)所示。

图5 PBS、AFB Nb70和Nb11-59共注射小鼠的临床前PET成像和分析。(a)皮下注射RBD后，KM小鼠静脉注射68GaNb1159与PBS、阴性对照纳米体和Nb11-59共注射临床前PET成像。白色箭头表示RBD的皮下注射。(b)三组小鼠共注射PBS (n = 4)、阴性对照纳米体(n = 5,1mg /只小鼠静脉注射)和Nb11-59 (n = 3,1mg /只小鼠静脉注射)中SUVmax的比较。(c) SUVmax与Nb1159共注入量的相关性。

使用设备

                                                        Super Nova^® Micro PET/CT（III 代外观图）