文献信息

近日，暨南大学生命科学与技术学院生命与健康工程研究院广东省高校功能蛋白研究重点实验室“肿瘤分子生物学”教育部重点实验室、首都医科大学北京同仁医院等单位的研究成果“In vivo genome-wide CRISPR screening identifies ZNF24 as a negative NF-κB modulator in lung cancer（体内全基因组CRISPR筛选发现ZNF24在肺癌中是NF-κB的负调节因子）在杂志Cell & Bioscience（IF：9.584）上发表。平生公司的小动物活体CT（Supernova）在论文中提供了重要的小鼠肺部肿瘤图像。

该研究的通讯作者陈良，第一作者为刘鹭。

文献摘要

肿瘤抑癌基因(tumor suppressor genes, TSGs)的系统鉴定及其信号通路的阐明为理解肿瘤发生提供了一个新的角度，对肺癌患者的成功治疗具有重要意义。在作者目前的工作中，通过CRISPR/Cas9介导的全基因组基因敲除进行了肺癌TSGs的体内筛选。作者发现ZNF24是肺癌的有效且临床相关的TSG。ZNF24的异位表达使肺癌细胞阻滞在S期。在机制上，ZNF24结合P65的启动子区域，负调控其转录，从而负调控NF-κB的信号通路活性。这种信号级联与临床相关。重要的是，作者发现KRAS、NF-κB和PD-1的三者联合抑制有效地减少了转基因小鼠模型中KrasG12D/ZNF24−/−肺癌的发生。作者目前的工作揭示了ZNF24功能缺失在肺肿瘤发生中的重要作用，为部分肺癌患者的精准医疗提供了新的思路。

实验方法

所有小鼠均在暨南大学指定的无病原体环境中饲养，所有实验方案均经暨南大学批准。所有动物工作都按照批准的规程进行。在单剂量病毒输注实验中，将双转基因小鼠的随机分为两组(每组3-4只)。Teton-KrasG12D/ CC10rtTA(指定KC)双转基因小鼠用含Dox的饲料喂养2个月诱导肺腺癌。过表达ZNF24的逆转录病毒(KC-Z)或对照(KC-C)通过鼻孔吸入肺部。小鼠恢复1周后饲喂含Dox的饲料，直至处死。用苏木精伊红染色肺组织。采用小动物活体CT (中国，平生医疗科技有限公司)对肿瘤负荷进行量化。

6-8周龄Lsl- KrasG12D小鼠经鼻吸入共表达Cre和CRISPR/Cas9的重组慢病毒。在感染6个月后，通过CT监测ZNF24敲除小鼠(K-sgZNF24小鼠)和Td-Tomato敲除小鼠(K-sgTD小鼠为对照)的T负荷。

将靶向ZNF24的sgRNA克隆到pSECC质粒中。在用于制备重组病毒之前，对合成质粒进行测序验证。这些病毒通过鼻孔滴入到Lsl-KrasG12D小鼠体内。肺癌诱导后6个月，通过计算机断层扫描(Supernova CT，平生医疗科技有限公司)记录肺负荷。用NF-κB抑制剂BAY11-7082 (selleckchem, 20 mg/kg/day)、BI3406 (selleckem, 25 mg/kg/day)和抗PD-1 (BioXcell, BP0033-2, 5 mg/kg)处理小鼠。采用CT监测肿瘤负荷。

实验结果

作者发现过表达ZNF24显著抑制肺癌的形成(图I, J)。检查苏木精和伊红(H&E)染色的肺组织切片显示逆转录病毒表达ZNF24显著抑制KC-Z肺的肿瘤形成。

图1 ZNF24在肺癌中是一种重要的抑癌基因。I：ZNF24表达对转基因小鼠原位肺肿瘤形成的影响。用表达对照病毒(KC-c)或ZNF24 (KC-Z)感染Teton-KrasG12D/CC10rtTA(指定KC)小鼠，用Dox饲料喂养2个月。通过CT扫描和组织学切片记录肿瘤负荷。标尺Bar = 500 μm。K：ZNF24表达对Lsl-KrasG12D小鼠肿瘤形成的影响重组慢病毒共表达Cre和CRISPR/Cas9，经鼻吸入感染Lsl-KrasG12D。K-sgZNF24小鼠和K-sgTD小鼠感染6个月后肺肿瘤形成的比较。通过CT扫描和组织学切片记录肿瘤负荷。标尺Bar = 500 μm。

然后，作者生成了一组K-sgZNF24肺癌小鼠，如图1M所示，并使用BAY11-7082、BI3406和抗小鼠PD-1抗体治疗这些小鼠2周（Fig.5G）. Micro-CT显示肺肿瘤几乎完全消退(图G, H)。

图5联合抑制KRAS、NF-κB和PD-1可有效抑制Kras^G12D/ZNF24−/−肺癌。G: BAY11-7082、BI3406和PD-1抗体(指定BAY+BI+PD-1)联合治疗可有效缩小K-sgZNF24小鼠肺部肿瘤。用共表达的重组慢病毒Cre和CRISPR/Cas9经鼻滴注处理Lsl-Kras^G12D小鼠。用BAY11-7082 (20 mg/kg/天，腹腔注射)、BI3406 (25 mg/kg/天，灌胃)和PD-1抗体(5 mg/kg，隔日一次，腹腔注射)治疗小鼠。CT记录肿瘤负荷。

文献结论

作者的研究描述了小鼠体内肺癌抑癌基因的全基因组筛选。结合作者的筛选结果和TCGA数据，作者发现ZNF24是一种新型的、有效的和临床相关的肺癌TSG。ZNF24通过诱导S期细胞周期阻滞发挥抑癌作用。作者进一步明确了其分子机制:ZNF24结合P65启动子区，抑制其转录;ZNF24抑制NF-κB通路信号通路活性及相关cyclin/CDKs的表达。ZNF24-P65-cyclin/ CDK轴与临床相关。作者还发现很大一部分肺癌患者中ZNF24基因缺失。作者目前的工作揭示了ZNF24功能缺失在肺肿瘤发生中的重要作用，为部分肺癌患者的精准治疗提供了新的思路。

使用设备

Micro CT（型号：Super Nova）（平生医疗科技）

             影像软件：Avatar（平生医疗科技）