近日，川北医学院药学院化学教研室、川北医学院口腔科&川北医学院附属医院口腔科、川北医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科和川北医学院基础与法医学学院免疫学系等团队的研究成果Positive space acquiring asymmetric membranes for guiding alveolar bone regeneration under infectious conditions（在感染条件下引导牙槽骨再生的非对称膜的正空间获取）在学术期刊Biomaterials Advances（原名Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications，影响因子8.457）发表。平生公司的小动物PET/CT（型号Super Nova） 产品在论文中提供了重要的牙槽骨CT图像和定量分析，把单CT系统的功能发挥出来，实现了一机两用。
该研究的第一作者为王冰博士。
文献摘要
为了获得适合在感染条件下引导牙槽骨再生的多功能材料，作者制备了不对称膜，包括包含成纤维细胞抑制剂聚(p-对氧环己酮- l -苯丙氨酸)(PDPA)的空间获取层，在两层之间形成屏障的隔离致密层和包含羟基磷灰石或羟基磷灰石&米诺环素的诱导成骨的静电纺丝层。然后分析了不对称膜的组成、结晶、形貌和亲水性。米诺环素结合膜控制牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis)体外扩增。羟基磷灰石掺入的非对称膜促进体外MC3T3-E1细胞成骨相关基因RUNX2、OPN、ALP的表达。羟基磷灰石不对称膜培养的MC3T3-E1细胞在体外也能促进矿化。不对称膜特别是羟基磷灰石结合膜在体内指导下颌骨缺损的再生。在感染条件下引导的骨再生在牙龈假单胞菌感染的牙槽骨缺损模型中进行评估。具体而言，含不对称膜的空间获取层有效控制缺损部位结缔组织增生。应用单间隙获取层膜获得良好的引导骨再生，进一步表明积极获取间隙对诱导骨再生的重要性。羟基磷灰石-米诺环素联合对称膜可同时抑制感染引起的牙槽骨重吸收，引导缺损再生。因此，羟基磷灰石-米诺环素结合的非对称膜可能更适合用于指导复杂感染条件下骨缺损的再生。
实验方法
不对称膜的体内成骨诱导作用
雄性SD大鼠24只，分为对照组、M-HA-AsM组、HA-AsM组和AsM组。戊巴比妥钠麻醉大鼠，固定头部后用碘伏消毒。随机选取下颌骨的一侧，切开皮肤和肌层，露出这一侧的下颌骨表面。使用牙科环钻在下颌骨产生一个渗透性骨缺损(⌀3mm)，并直接解剖缺损部位肌肉组织。然后，将膜(⌀5mm)放置在骨缺损两侧，面向下颌骨表面形成成骨诱导层。对照组在缺损部位注射0.2 mL生理盐水，不植入任何膜。最后，在下颌缺损产生后立即将肌肉和皮肤逐层缝合。然后，在术后0、2、4、6或8周，对小动物使用正电子发射断层扫描-计算机断层扫描(PET-CT)(单CT模式，平生医疗科技昆山有限公司)监测大鼠骨缺损再生。测定覆盖骨缺损的骨缺损直径和骨体积与总组织体积(3mm × 3mm × 3mm)的比值(BV/TV)。术后8周处死大鼠，取下颌骨缺损部位及周围软组织，用4%多聚甲醛固定。固定标本用乙二胺四乙酸(EDTA;10%)脱钙和石蜡包埋。采集的组织切片，用HE和马松三色染色。
不对称膜在体内感染条件下引导牙槽骨缺损再生的作用
雄性SD大鼠30只，分为对照组和4个膜植入组。然后用戊巴比妥钠麻醉大鼠，固定鼠头并用碘伏消毒。将大鼠上颌第一磨牙周围的腭瓣切开并折叠。随机选取下颌骨一侧，用牙环钻取出腭侧牙槽骨(长2 mm ×宽2 mm ×深1 mm)。在钻孔过程中，使用低温盐水(0.9%)冲洗手术表面，以降低钻孔时牙槽骨的温度。清创术后，将静电纺丝膜放置于牙槽骨上方。下颌骨另一侧缺损注射生理盐水(0.2 mL)作为对照。然后使用可生物降解的材料闭合牙龈瓣，将牙龈P. gingivalis悬浮液(10 μL;1 × 107 CFU mL−1)注射到缺陷部位。每组一半大鼠在术后0、2、4、6、8周使用PET-CT扫描(单CT模式，平生医疗科技有限公司)监测小动物感染诱导骨吸收和牙槽骨缺损再生的进展。确定牙槽骨缺损体积和周围软组织状况。8周后对大鼠实施安乐死，取牙槽骨(包括第一磨牙及周围软组织)，用多聚甲醛固定(4%)，EDTA脱钙(10%)，石蜡包埋。采集的组织切片，用HE和马松三色染色。
实验结果
在体内评价M-HA-AsM、HA-AsM和AsM组对引导大鼠下颌骨缺损再生的影响，进一步验证膜的成骨诱导作用。由于PDPA-M膜的体外成骨效果最差，且对下颌骨缺损的结缔组织压力可以忽略不计，因此未使用PDPA-M膜进行体内成骨诱导实验。如图4所示，对照组BV/TV和最大骨缺损直径均随术后时间的延长而缓慢升高和降低。相比之下，膜处理组BV/TV和最大骨缺损直径的增加和减少均快于对照组。换句话说，M-HA-AsM、HA-AsM和AsM组在不同程度上加速了骨缺损再生。在M-HA-AsM、HA-AsM和AsM组中，M-HA-AsM和HA-AsM诱导骨再生的效果优于AsM，这与体外成骨诱导实验结果一致。电纺成骨诱导层的多孔形态为成骨细胞和其他成骨相关细胞的粘附和爬行提供了支架。这促进了骨生成。因此，三种不对称膜均促进骨缺损再生。与AsM组相比，M-HA-AsM组，尤其是HA-AsM组缺陷部位BV/TV值明显升高，这可能与其中HA成分诱导成骨和导骨有关。M-HA-AsM诱导成骨的效果略弱于HA-AsM的原因可能是M-HA-AsM中的抗生素(米诺环素)略微抑制了成骨相关的细胞扩张，如图3a所示。
因此，为了进一步研究缺损部位的骨再生情况，作者在缺损部位进行了病理相关实验，结果如图5所示。显然，M-HA-AsM组和HA-AsM处理组再生骨增厚范围更广，这与图4所示CT扫描图像一致。
图4。(a)不同膜处理大鼠下颌骨缺损的CT扫描图像和三维重建。(b)下颌骨缺损最大直径随术后时间的变化(*表示与对照组比较P < 0.05)。(c)测量下颌骨缺损部位的BV/TV，并绘制成术后时间的函数图(*表示与对照组相比P < 0.05)
图6a为不同膜处理的牙槽骨缺损CT扫描重建的三维图像。图6b为术后8周三个方向的二维CT图像。图6c为CT扫描重建三维图像所得牙槽骨缺损体积的统计分析结果。图6d为术后8周CT扫描重建的软组织3D图像。除M-HA-AsM治疗组外，其余各组大鼠术后2周内牙槽骨重吸收明显，如图6a和c所示。这一结果表明，对照组和HA-AsM、AsM、PDPA-M治疗组大鼠牙周炎在2周内进展迅速。因此，M-HA-AsM组通过联合抗生素米诺环素有效阻断牙周炎的形成和发展。
此外，图6b所示的结果显示，在术后8周，对照组和AsM治疗组大鼠牙根间隙存在广泛的骨再吸收，但M-HA-AsM、HA-AsM和PDPA-M治疗组大鼠牙根间隙或牙根未观察到明显的牙槽骨再吸收。这表明对照组和AsM治疗组牙周炎进展和感染诱导的骨重吸收在8周后仍未修复。
除AsM治疗组大鼠外，其余实验组大鼠均出现牙槽骨缺损体积开始增加的现象两周后略有恢复。提示急性细菌感染期后骨缺损已恢复。经膜处理的大鼠恢复情况均优于对照组。这说明所有的膜都能在一定程度上支持成骨细胞的扩散或成骨分化。HA-AsM组大鼠牙槽骨恢复最多，AsM组大鼠牙槽骨恢复最少，甚至在术后6周开始恢复。这说明M-HA-AsM、HA-AsM和PDPA-M具有较好的牙周炎抑制和骨再生诱导作用。
特别是PDPA-M组(含有一个抑制纤维化的PDPA层)能很好地引导骨再生。结缔组织增生(尤其是炎症刺激增生)严重损害牙龈部位牙槽骨缺损的再生，是牙周炎患者骨再生的主要障碍。为了更清晰地观察结缔组织增生，根据不同实验部位的CT扫描重建软组织三维图像，如图6d所示。显然，对照组和AsM治疗组结缔组织致密增生性。虽然骨缺损没有完全修复，但PDPA-M处理组没有出现明显的增生性结缔组织，M-HA-AsM和HA-AsM处理组出现了一些松散的增生性结缔组织。正如作者之前的研究所证明的那样，当PDPA共聚物降解时，L-Phe(抑制成纤维细胞膨胀)被释放出来，纤维结缔组织增生可以被抑制。PDPA- M是一种可快速降解的多孔单层PDPA膜。另外三种膜均为多层复合膜，其中疏水PLGA/PLCA隔离层的加入降低了膜的亲水性，减缓了PDPA层的降解。因此，纤维化抑制M-HA-AsM、HA-AsM和AsM的正向空间获取效应均弱于PDPA-M。在M- HA-AsM组、HA-AsM组和AsM组中，AsM的亲水性最差，其抑制纤维化的效果最差。
图6所示 (a)用不同膜处理的牙槽骨缺损的CT扫描重建的3D图像。(b)不同膜治疗牙槽骨缺损术后8周CT扫描图像。(c)牙槽骨缺损体积随术后时间的变化(*表示与对照组比较P < 0.05)。(d)术后8周手术部位软组织CT扫描重建3D图像。
文献结论
为了指导感染条件下的牙槽骨缺损再生，制备和评估了不对称膜。米诺环素联合M-HA-AsM体外抑制牙龈假单胞菌增殖。HA-AsM和PDPA-M支持MC3T3-E1细胞体外增殖。由于M-HA-AsM释放二甲胺四环素，在培养后期对MC3T3-E1细胞有轻微的细胞毒性。由于M-HA-AsM和HA-Asm含有成骨诱导HA，在体外可促进MC3T3- E1细胞的成骨分化和矿化。这些膜，特别是M-HA-AsM和HA-AsM，在体内指导下颌骨缺损的再生。在感染条件下，在牙龈假单胞菌感染的牙槽骨缺损模型中评估骨缺损再生指导。所有膜均引导牙槽骨缺损再生。由于其低生物相容性，AsM表现出最差的综合骨修复。具体而言，M-HA-AsM、HA-AsM和PDPA- m在缺陷部位有效抑制结缔组织增生，抑制纤维化，PDPA层表现出正空间获取功能。利用PDPA-M获得良好的骨再生指导，进一步表明积极获取空间对诱导骨再生的重要性。此外，不对称HA-AsM诱导骨再生效果最好，因为HA-AsM同时具有诱导成骨和获得正空间的功能。在牙龈P. gingivalis感染的大鼠模型中，M-HA-AsM的牙周炎诱导骨再生能力略低于HA-AsM。尽管由于米诺环素的加入，M-HA-AsM仍然抑制了进进式牙槽骨吸收，因此可能更适合在复杂的感染条件下应用。
使用设备
Super Nova® Micro PET/CT II代产品（平生医疗科技）
影像软件：Avatar（平生医疗科技）
苏公网安备32058302003603
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