文献信息

近日，甘肃农业大学生命科学技术学院、中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院基础医学实验室、甘肃省干细胞与基因药物重点实验室共同合作的研究成果“阿仑膦酸钠对去卵巢小鼠骨质量及脏器病理学的影响”在学术期刊《海南医学院学报》上发表。平生公司的Micro-CT(型号：NMC-200)产品为论文提供了重要的小鼠股骨Micro-CT图像和定量分析。

该研究的通讯作者为甘肃农业大学生命科学技术学院陈克明教授。第一作者为甘肃农业大学生命科学技术学院在读研究生王龙飞。

文献摘要

探究阿仑膦酸钠对去卵巢小鼠骨质量和脏器病理学的影响

实验目的：将30只SPF级C57雌性小鼠随机分为3组，每组10只，分别为假手术组(Sham)，去卵巢组(OVX)和去卵巢+阿仑膦酸钠组(ALN)，ALN组每周阿仑磷酸钠400µg/kg 皮下注射2次，Sham组和OVX组每周等体积的生理盐水皮下注射2次，给药12周后取材，分别观察脏器系数、主要脏器病理学切片、骨组织病理学切片、分析Micro CT、L4椎体生物力学和血清生化指标。

实验结果：Sham组子宫系数(0.0054±0.0007)显著高于OVX组(0.0026±0.0009)和ALN组(0.0025±0.0007)小鼠的子宫系数，差异具有统计学意义(P<0.05)。主要脏器未发现明显的病变和毒副作用。骨组织脱钙切片ALN组与OVX 组相比骨小梁结构致密，脂肪细胞较少。micro CT结果显示，ALN组的Tb.BMD、Tb.N、Tb.Th和Tb.BV/TV与OVX组相比，均有显著性增加，但Tb.Sp数值显著性减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。L4 zhui体生物力学中ALN组的弹性模量(50.29±13.43)和最大载荷数(29.83±4.92)显著高于OVX组的弹性模量(14.77±3.12)和最大载荷数(11.57±3.18)，差异具有统计学意义(P<0.05)。ALN组血清中骨形成指标OCN和PINP OVX组相比都呈上升趋势，骨吸收指标TRACP-5b和CTX-I都呈下降趋势，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实验结论：阿仑膦酸钠可能是通过增加骨密度、改善骨微结构、提高骨强度、促进骨形成、抑制骨吸收从而提高骨质量，并且对脏器没有明显的毒副作用。

实验方法

实验动物与分组处理

8周龄SPF级C57BL/6小鼠30只，体重(18±2)g，购自空军军医大学实验动物中心，合格证号：SCXK(陕)2019-001。饲养于联勤保障部队第九四〇医院SPF 级动物实验中心，许可证编号：SYXK(军)2017-0047。小鼠造模前按随机数字表法分为3组，每组10只，分别为假手术组(Sham)、去卵巢组(OVX)及去卵巢+阿仑膦酸钠组(ALN)。除Sham组切除卵巢体积相同脂肪外，其余各组均由背部行双侧卵巢摘除术。术后连续肌注3天青霉素。ALN组每周阿仑磷酸钠400µg/kg皮下注射次，Sham组和OVX组每周等体积的生理盐水皮下注射2次。为防止切卵巢后小鼠体重上升过快，每天给小鼠定量喂食，所有小鼠的喂食量按照假手术组每天进食量给予，术后周开始给药。实验期间注意皮毛的色泽、观察小鼠生理反应与生活习性的变化，每一周称一次体重。给药第12周处死小鼠取材，取材前禁食不禁水24小时。

Micro CT分析

小鼠取材时，每组随机挑出6根左侧股骨固定在4%多聚甲醛中。固定好的样本存放于4℃冰箱内。实验时，用镊子取出样本并用纱布擦走多余的液体后，用干净的纸巾将样品包裹放入Micro CT设备中。扫描后得到大量层切图片，再经重建软件进行3D重建，截取最大剖面图与横截面图。选择骨骺线下1mm至1.5mm处为感兴趣区进行分析，得到分析区域松质骨的骨形态参数。选择骨 骺线下 2.5mm至3mm处为感兴趣区进行分析，得出该区域皮质骨的骨形态参数。得到横截面图、最大剖面图以及骨形态参数包括骨小梁骨密度(Tb.BMD)、骨小梁数(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨体积分数(Tb.BV/TV)、皮质骨密度(Ct.BMD)和皮质骨厚度(Ct.Th)。

实验结果

Micro CT 扫描及分析

股骨正中剖面图(图3)显示，OVX组与Sham组相比，松质骨比较疏松， 骨小梁数量减少，骨小梁间间距扩大，骨小梁与骨小梁间的连续性与延展性较差。其中ALN组与Sham组相比，股骨松质骨的骨微结构质量基本一致。从骨小梁横切图(图4)显示，OVX组骨小梁比较稀疏，Sham组和ALN组明显更加紧密。从骨小梁3D图(图5)看出OVX组骨小梁数目明显较少，Sham组和ALN组骨小梁数目明显较多。从皮质骨3D图(图6)和皮质骨横切(图7)未发现OVX组与Sham组和ALN组的明显差异。

由表2可见，通过比较松质骨和皮质骨的骨形态参数，发现ALN组的小鼠与OVX组小鼠比较，数值在Tb.BMD、Tb.N、Tb.Th 和Tb.BV/TV均有显著性增加、Tb.Sp数值显著性减少(P＜0.01)，证明ALN提高骨质量，是通过增加骨密度和改善骨组织的结构。ALN组与OVX组的Ct.BMD和Ct.Th比较无统计学差异(P>0.05)。

                     图3  小鼠股骨Micro CT成像分析最大剖面图

                      图4  小鼠股骨Micro CT成像分析骨小梁横切 

                       图5  小鼠股骨Micro CT成像分析骨小梁3D

                      图6 小鼠股骨Micro CT成像分析皮质骨3D

                      图7  小鼠股骨Micro CT成像分析皮质骨横切 

文献结论

Micro CT是骨组织微观结构鉴定的新方法，可以从三维层面精准地反映皮质骨与松质骨的微结构。Micro CT有直观、准确和灵敏度高等特点，是骨科基础疾病研究常用的一种有效的可靠手段，特别在骨质疏松症相关的大小鼠实验中运用最多。本次以实验小鼠股骨为对象，分析最大剖面图与立体三维重建图，通过二维和三维的角度分析小鼠股骨的微观结构并得到准确的松质骨和皮质骨量化指标结果。直观体现松质骨和皮质骨的微观构造，同样得到皮质骨和松质骨量化数值。Micro CT结果显示，ALN都能增加骨小梁数量、加大骨小量厚度、减小骨小梁间距、加强骨小梁的连续性，使得松质骨内部的骨小量更加紧致，在微观层面加强骨质量并提高骨强度。说明ALN可以预防小鼠切卵巢引起骨的丢失，增加骨质量。

                                  Micro CT（型号：NEMO）（平生医疗科技）

                                          影像软件：Avatar（平生医疗科技）