文献信息

北京大学药学院天然药物仿生药物国家重点实验室和北京大学第一医院团队合作得研究成果“Noncanonical amino acids as doubly bio-orthogonal handles for one-pot preparation of protein multiconjugates(非标准氨基酸作为双生物正交处理一锅制备蛋白质多缀合物)”在学术期刊Nature Communications(影响因子17.694)发表。平生公司的小动物PET/CT(型号：Super Nova)产品在论文中提供了重要的肿瘤小鼠PET/CT图像和定量分析。

该研究的通讯作者为北京大学药学院刘涛教授和北京大学第一医院杨兴教授。北京大学药学院刘涛教授团队博士后王永，硕士研究生韩伯阳以及北京大学第一医院杨兴教授团队博士研究生张景明为该文的共同第一作者。团队成员谭琳致，蔡文康，李雨轩，苏晔宇，余宇彤，王昕，段小江，王浩宇以及天然药物及仿生药物国家重点实验室仪器平台指导老师师晓萌，王静，医药卫生分析中心仪器平台指导老师钟丽君等也为该研究做出了重要贡献。该研究得到国家自然科学基金《多层次手性物质的精准构筑重大研究》，国家重点研发计划合成生物学专项，北京大学临床+X青年专项，以及北京市杰出青年基金等科研项目的大力支持。

文献背景

治疗性蛋白质，比如抗体，激素，干扰素，白细胞介素，酶等等在各类疾病治疗领域发挥着重要的作用，但是这些天然蛋白由于成药性的缺陷，如疗效差，半衰期短，系统性用药毒性大，免疫原性高等问题，难以满足当前科研和临床的需求。对蛋白质进行化学修饰逐渐成为一种重要的对其成药性进行改造的手段。蛋白质的双修饰或者多修饰在实现多功能蛋白药物的开发方面变得尤为重要。

用于位点特异性蛋白质修饰的非匿名氨基酸(ncAA)的遗传编码已广泛应用于许多生物学和治疗应用。为了有效地制备均匀的蛋白质多缀合物，作者设计了两种可编码的非编码氨基酸(ncAAs)，4-(6-(3-叠氮基丙基)-s-四嗪-3-基)苯丙氨酸(pTAF)和3-(6-(-3-叠氮基)-s-三嗪-3-基苯基)苯丙氨酸(mTAF)，它们包含相互正交和生物正交的叠氮和四嗪反应手柄。含有TAFs的重组蛋白和抗体片段可以以即插即用的方式与市售荧光团、放射性同位素、PEGs和药物的组合在一锅反应中容易地功能化，以提供蛋白双缀合物，以评估小鼠模型中肿瘤诊断、图像引导手术和靶向治疗的组合。此外，作者证明，通过两个无义密码子将mTAF和含酮ncAA同时结合到一个蛋白质中，可以制备位点特异性的蛋白质三联体。作者的结果表明，TAF是双生物正交处理，可用于高效和可扩展的多复合物制备。

实验方法

PET成像研究

⁶⁴Cu标记的Fab-CY5-NOTA 22Rv1荷瘤小鼠(n=4)在100μL PBS缓冲液中静脉注射3.70–4.44 MBq[⁶⁴Cu]Fab-CY5-NOTA。在相应的成像时间之前，用2.5L/min的异氟烷麻醉小鼠，并将其放入micro-PET/CT扫描仪(Super Nova^®，平生医疗科技有限公司)。在注射后1小时、6小时、12小时和24小时进行PET/CT成像。使用Avatar软件分析图像(版本1.6.6.5)使用3D  OSEM+PSF算法重建PET数据。

实验结果

作者用双模态抗体片段评估了连续PET和荧光成像的效果(图4b)。将携带22Rv1肿瘤的小鼠静脉注射3.7–4.44 MBq ⁶⁴Cu-J591Fab-CY5，并在不同时间点收集PET图像。PSMA阳性的22Rv1肿瘤早在1小时p.i.就被特异性地观察到，并在24小时p.i.内持续可见。然后，作者还进行了荧光成像和成像引导下的肿瘤切除术。在荧光图像中清晰地观察到22Rv1肿瘤，可以完全切除。在周围正常组织中没有观察到明显的荧光信号(图4d)。用抗PSMA抗体对切除的肿瘤组织进行免疫荧光成像(图4e)。

制备抗PSMA抗体片段双缀合物，用于小鼠PSMA阳性肿瘤的显微PET成像和荧光图像引导手术。C注射⁶⁴CuJ591Fab-CY5后不同时间点皮下22Rv1肿瘤的显微PET成像(由白色虚线圆圈表示)。

文献结论

总之，作者开发了一个方便、多功能的平台，通过GCE将含有两个相互正交和生物正交反应基团的ncAA进行位点特异性掺入，可以方便地获得高产率的蛋白质双重和多重缀合物。该平台可以很容易地用于利用市售的蛋白质修饰试剂来扩展蛋白质的功能效用，从而使其成为研究将功能分子的各种组合附着到感兴趣的蛋白质上的后果的经济选择。可以预期，该平台对于扩大基于蛋白质的治疗方法的范围和产生治疗方法(例如与抗体结合的各种药物的组合)尤其有价值，这些药物可以克服当前可用的免疫治疗的局限性。

使用设备

                                                      Super Nova^® Micro PET/CT（III 代外观图）