文献信息

浙江省病理生理学重点实验室，宁波大学医学院、宁波市第一医院医学研究中心等团队合作的研究成果“BMSCs and Osteoblast-Engineered ECM Synergetically Promotes Osteogenesis and Angiogenesis in an Ectopic Bone Formation Model(骨髓间充质干细胞和成骨细胞工程化ECM协同促进异位成骨和血管生成)在杂志Frontiers in Bioengineering and Biotechnology(IF:6.064)上发表。平生公司的离活一体CT(NEMO)在论文中提供了重要的成骨材料图像和定量分析。

该研究赵基源教授和李梅副研究员为共同通讯作者，张迟和夏冬冬为共同第一作者。

文献摘要

骨髓间充质干细胞(BMSC)已广泛用于骨组织工程，因为它们具有多分化、旁分泌和抗免疫反应的潜力。生物材料对于BMSCs在体内植入后的存活和活动至关重要。最近，具有有利骨再生微环境的细胞外基质(ECM)修饰已被证明是细胞活动和骨再生有效方法。本研究的目的是评估BMSCs与细胞工程ECM支架相结合对体内成骨和血管生成的影响。ECM支架由小肠粘膜下层(SIS)上培养4周的成骨细胞去细胞化得到，该成骨细胞培养期间用富含钙(Ca)的培养基和淫羊藿苷(Ic)处理。在小鼠异位骨形成模型中，SIS支架被证明可以降低免疫反应， 与假手术组相比，免疫细胞水平降低。Ca/Ic-ECM修饰抑制了体内SIS支架的降解。根据显微CT和组织学染色的结果，Ca/Ic-SIS支架可异位促进成骨。此外，Ca/Ic-SIS上的BMSCs进一步增加了骨体积百分比(BV/TV)和骨密度。此外，Ca/Ic-SIS支架也增强了血管生成，根据CD31染色的数据，显示最高水平的新血管形成。总之，定向诱导下的成骨细胞工程ECM是一种很有前途的策略，是可以用于成骨和血管生成的生物材料。BMSCs协同工程化的ECM有助于修复大缺损骨的修复。

实验方法

仿生ECM修饰SIS支架的制备

冻干SIS支架SIS支架被切成直径5毫米的圆形结构，用于通过活检穿孔器进行体内实验。将MC3T3-E1细胞接种在SIS支架上4周以获得丰富的ECM。对于Ca/Ic-SIS制备，CaCl2和淫羊藿苷的浓度按照之前研究中的描述进行选择.简而言之，在细胞培养前，将支架在37°C的完全培养基中再水化至少24小时。将大约5×10⁴MC3T3-E1细胞滴在SIS支架上。第二天，将带有细胞的SIS支架转移到新的96孔板中，并在常规培养基或诱导培养基(含有10mM CaCl₂和10μM淫羊藿苷)中培养4周。培养基每隔一天更换一次。如前所述进行脱细胞化。简而言之，将样品在-80°C冰箱和37°C水浴中进行三个冻融循环(每个步骤30分钟)。在每个解冻步骤后，将支架在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冲洗以去除细胞成分。脱细胞后，生成两种仿生ECM修饰的SIS，并在使用前储存在-80°C。

小鼠皮下移植后SIS支架的免疫反应

体重20-25g的八周龄雄性ICR小鼠用于评估体内植入支架后的免疫反应。小鼠随机分为四组(Ca/Ic-SIS 组、ECM-SIS组、SIS组和假手术组)。支架(Φ5mm)通过手术植入ICR小鼠的皮下部位。在没有支架植入的情况下接受外科手术的假手术组被认为是对照。手术在全身麻醉下进行，麻醉通过腹腔注射1.2%Avertin-PBS溶液(20-25μl/g)。收集来自尾静脉的血液(20μl)并与1.2ml稀释剂混合。使用血细胞分析仪在不同时间点(1、2、3、5、7、9、11d天)检测白细胞(WBCs)、单核细胞(MONs)和淋巴细胞(LYMs)的水平、13、15、18、21和24天)。在每个时间点对每组进行四次重复测定，取平均结果。

SIS支架的体内降解试验

支架(Φ5mm)分为以下六组:SIS、ECM-SIS、Ca/Ic-SIS、SIS+BMSCs、ECM-SIS+BMSCs和Ca/Ic-SIS+BMSCs，每组四只动物。所有组均通过手术单独植入ICR小鼠的皮下部位。8周后通过大体观察检测到体内支架的降解。

Ca/Ic-SIS支架与BMSCs对异位成骨的影响

小鼠皮下移植模型用于评估由Ca/Ic ECM修饰的SIS支架诱导的异位成骨和血管形成。动物随机分为以下六个治疗组(Φ5mm，n=4):SIS、ECM-SIS、Ca/Ic-SIS、SIS+ BMSCs、ECM-SIS+BMSCs和Ca/Ic-SIS+BMSCs。在用BMSC处理的组中，将1×10⁵细胞接种在浸泡在普通培养基中的SIS、ECM-SIS或Ca/Ic-SIS支架上。37°C孵育12小时以允许细胞附着，然后将细胞/支架复合材料通过手术植入ICR小鼠的双侧皮下。手术在全身麻醉下进行，麻醉通过腹腔注射1.2%Avertin-PBS溶液(20-25μl/g)。手术后8周处死所有动物。

显微CT分析

8周后，使用显微CT扫描仪(NEMO Micro CT；平生医疗科技有限公司)对植入物进行成像和评估。标本的扫描CT图像使用90kV和60μA获取，并使用计算机软件(Recon；平生医疗科技有限公司)进行三维(3D)重建。比较各组缺损部位再生骨量、骨密度、感兴趣区(ROI)组织密度。

实验结果

Ca/Ic ECM修饰促进异位骨形成

显微CT用于分析植入基于SIS的支架后8周的异位骨形成。最初，在手术前后对带有支架的整个组织进行了评估。如图所示图 3A、B, ECM-SIS和Ca/Ic-SIS支架的密度(A)和体积(B)明显高于移植前的原始SIS支架。体内8周后，Ca/Ic-SIS支架的体积在有或没有BMSCs的三种植入物中最高，这与图1中显示的大体视图一致图2。结果进一步证实，Ca/Ic修饰能够减缓体内SIS支架的降解。BMSCs进一步增加了植入后Ca/Ic-SIS的密度，说明BMSCs可促进Ca/Ic-SIS植入后体内细胞的募集和黏附(图3A)然后，BV/TV和骨体积用于评估再生骨的数量，骨密度用于评估再生骨的质量(图3C–F).结果显示在原始SIS组中，异位骨模型中无论有无BMSCs移植均未检测到新骨(图3C)，而无论是否存在BMSC，ECM修饰的SIS组(ECM-SIS和Ca/Ic-SIS)中新生骨都很明显(图3C)。此外，根据 BV/TV 评估和骨体积测量值，使用Ca/IcSIS植入物的组新骨形成水平高于其他组(图3D)(图3F)，BMSCs的加入进一步增加了Ca/IcSIS植入物的BV/TV(图3D)和骨密度(图3E)。

小鼠皮下植入8周后ECM-SIS和Ca/Ic-SIS诱导异位骨形成的显微CT评价(含或不含BMSCs)。Micro CT分析植入前后支架的密度(A)和体积(B)。(C)植入后8周具有代表性的三维重建显微ct图像。基于三维重建图像计算各组新骨形成率(D)、再生骨密度(E)和感兴趣区域骨体积(F)。(n=3).*,p < 0.05， **，p < 0.01， ***，p < 0.001。

文献结论

总之，本研究发现了组织工程骨模拟支架(Ca/Ic-SIS)在异位成骨模型中的多种潜在影响，包括免疫反应、支架降解、异位骨形成和血管生成。作为天然ECM生物材料，经过或未经过成骨ECM修饰的SIS支架均表现出低免疫原性和手术早期引起的免疫反应降低。成骨ECM修饰延迟了SIS支架的降解，尤其是当支架被Ca/Ic-ECM修饰时。此外，两种成骨ECM修饰的SIS(ECM-SIS和Ca/Ic-SIS)被证明可以促进异位骨形成，并且BMSCs的掺入进一步促进了Ca/Ic-SIS组的新骨形成。Ca/Ic-SIS支架表现出最优的促血管生成作用，尤其是在掺入BMSC之后。这些数据和作者之前的研究结果表明，在特定条件下的成骨ECM修饰是提高骨组织工程中支架材料性能的有效策略，并可通过协同BMSCs加速组织修复。

使用设备

                                  Micro CT（型号：NEMO）（平生医疗科技）

                                          影像软件：Avatar（平生医疗科技）