文献信息

北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所，核医学科，国家药监局放射性药物研究与评价重点实验室，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室、贵州大学医学院等团队合作的研究成果Construction and Preclinical Evaluation of ¹²⁴I/¹²⁵I‑Labeled Antibody Targeting T Cell Immunoglobulin and Mucin Domain‑3（靶向T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域-3的¹²⁴I/¹²⁵I标记抗体的构建及临床前评估）在学术期刊《Molecular Pharmaceutics》发表。平生公司的小动物PET/CT（型号：Super Nova）产品在论文中提供了重要的肿瘤小鼠PET/CT图像和定量分析。

该研究的通讯作者为北肿杨志主任，朱华研究员以及赵传科副教授。第一作者为淘金萍同学，曾子晴医师以及何成雪同学。

文献背景

摘要:T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3 (TIM3;HAVCR2)是一种跨膜蛋白，对T细胞反应施加负调节控制。研究表明，TIM3在肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)中的表达上调。本研究利用杂交瘤技术制备了一系列靶向TIM3的单克隆抗体。其中，C23表现出良好的生物学特性。为了实现特异性结合，作者通过n -溴琥珀酰亚胺(NBS)介导的单克隆抗体C23标记开发了¹²⁴I/¹²⁵I-C23放射性示踪剂。使用过表达TIM3的293T-TIM3细胞系和亲本293T细胞评估结合亲和力和特异性。在HEK293TIM3异种移植模型和4T1-(小鼠乳腺癌细胞)和CT26(小鼠结肠癌细胞)异体移植模型中检测¹²⁴I/¹²⁵I-C23的生物分布和体内成像。分别在3.7~7.4 MBq ¹²⁴I-C23静脉给药后4、24、48、72和/或96小时对模型小鼠进行微PET/CT成像。此外，对解剖肿瘤器官中TIM3的表达进行免疫组化(IHC)染色，并评估肿瘤中相应的程序性死亡1 (PD1)、CD3和CD8的表达。C23单克隆抗体(mAb)特异性结合TIM3蛋白，解离常数为23.28 nM。成功制备了¹²⁴I-C23和¹²⁵I-C23示踪剂，标记率分别为83.59±0.35%和92.35±0.20%，放射化学纯度超过95.00%。稳定性结果表明，¹²⁴I/¹²⁵I-C23在磷酸盐缓冲盐水(PBS)和5%人血清白蛋白(HSA)中的放射化学纯度在96 h后仍>80%，293T-TIM3细胞对¹²⁵I-C23的摄取为2.80±0.12%，显著高于293T细胞(1.08±0.08%)，阻断组在60和120 min时均显著阻断293T-TIM3细胞对¹²⁵I-C23的摄取。体内药代动力学分析显示，¹²⁵I-C23的消除时间为14.62h，分布时间为0.4672h。显微PET/CT成像显示，293T-TIM3模型¹²⁴I-C23探针摄取与阴性对照组和阻断组的探针摄取有显著差异。在人源化小鼠模型中，¹²⁴I-C23探针在4T1和CT26模型中有明显的特异性摄取，24h时在肿瘤组织中有最大的摄取(4T1和CT26人源化TIM3小鼠肿瘤模型的SUVmax(最大标准化摄取值)分别为0.59±0.01和0.76±0.02)。来自这些小鼠模型的肿瘤组织的免疫组织化学显示相似的TIM3表达。TIM3表达的肿瘤组织中也有CD3、CD8细胞和PD-1的表达。TIM3靶向抗体C23具有良好的亲和力和特异性。¹²⁴I/¹²⁵I-C23探针在体外和体内对TIM3具有明显的靶向特异性。作者的结果表明¹²⁴I/¹²⁵I-C23是一种很有前途的TIM3成像示踪剂，在监测免疫检查点药物疗效方面可能具有很大的潜力。

实验方法

动物异种移植物模型和显微PET/CT成像

所有动物实验均经北京大学肿瘤医院实验动物伦理委员会批准。本研究使用健康雌性NOD SCID、BALB/c-nu和KM小鼠均为4~6周龄，TIM3人源化BALB/c小鼠。采用NOD SCID小鼠接种3×10⁶个293T/293T-TIM3细胞构建293T/293T-TIM3异种移植模型，BALB/c-nu小鼠接种3×10⁶个A549-TIM3细胞构建A549-TIM3异种移植模型，BALB/c小鼠(hTIM3)右腋窝接种4T1或CT26细胞建立异种移植模型。当肿瘤体积达到约0.5−1cm³时，进行动物实验。在0.5%碘化钾 (KI)溶液阻断甲状腺后，异种移植模型和同种异体移植模型通过尾静脉注射124I-C23 (3.7-7.4 MBq)。然后在不同的时间点进行静态PET扫描15分钟。重建显微PET数据。最大标准化摄取值(SUVmax)是通过描述每个器官的感兴趣区域(ROI)来估计的。

实验结果

将¹²⁴I标记的C23单克隆抗体注射到293T和293T-TIM3荷瘤小鼠体内，进行微PET/CT成像。在阻断组中，除¹²⁴I-C23外，向携带293T-TIM3的小鼠注射过量的C23抗体。通过正电子发射断层扫描(PET)图像描绘293T和293T-TIM3模型小鼠各器官的ROI，并获得SUVmax。¹²⁴I-C23被肝脏代谢，更多分布于血管化程度较高的器官，如肝脏和肺(图4B−4D)，这与生物分布研究的结果一致。与阴性对照组和阻断组相比，实验组293T-TIM3肿瘤组织对探针有明显的摄取(图4A)。此外，注射后24h, 293T-TIM3模型肿瘤的SUVmax与阻断组的SUVmax相比有显著差异(0.46±0.0047 vs 0.40±0.0163 vs 0.36±0.0082,P < 0.01)(图4B−4D)。

图4.肿瘤模型的显微PET/CT成像。(A)注射¹²⁴I-C23探针后4、24、48、96 h对293T/293T-TIM3异种移植模型进行微PET /CT成像，白色箭头显示肿瘤已定位。(B)注射¹²⁴I-C23后不同时间点293T-TIM3模型小鼠各器官的SUVmax;(C)注射¹²⁴I-C23后不同时间点293T模型小鼠各脏器的SUVmax;(D) ¹²⁴I-C23和100mg/kgC23阻断后293T-TIM3模型小鼠各器官不同时间点的SUVmax。

将¹²⁴I-C23注射到A549-TIM3模型进行显微PET/CT成像(图5A)，注射后2h测得最高摄量 (SUVmax=0.89±0.0163);此外，A549-TIM3模型的代谢与293T-TIM3模型的代谢一致(图4A)。此外，A549和A549-TIM3肿瘤区域的¹⁸F-FDG显微PET/CT成像显示SUVmax无显著差异(图5B)。

文献结论

在这项研究中，TIM3被证明是预测性生物标志物的可行靶点，而¹²⁵I-C23的体内生物分布和药代动力学研究可能有助于更好地了解免疫治疗反应。¹²⁴I-C23的Micro PET/CT成像显示出良好的肿瘤背景摄取和靶向特异性，这为进一步研究¹²⁴I/¹²⁵I-C23和其他TIM3预测性生物标志物提供了支持。在未来，免疫治疗生物标志物成像可用于治疗监测和患者分层。

使用设备

                                                          Super Nova^® Micro PET/CT（III 代外观图）