研究背景: 加味通窍活血汤是在清代王清任《医林改错》中通窍活血汤的基础上化裁而来，由石菖蒲15g，赤芍12g，川芎12g，桃仁15g，红枣15g，红花12g，葛根12g，生姜12g，全蝎9g，麝香0.15g等药物组成，具有活血化瘀通络的作用。多项临床试验研究显示，加味通窍活血汤不但能改善患者椎、基底动脉的血流速度，而且还能改善血流量和管壁剪切力的血流参数，但其分子机制尚未阐明。

研究目的:本研究旨在建立BAD小鼠模型，探讨JTHD（加味通窍活血汤）的作用机制。

材料与方法:造模后C57/BL6雌性小鼠60只，随机分为假手术组、模型组、阿托伐他汀钙片组、JTHD低剂量组、JTHD高剂量组。经过14天的建模，药物干预疗程2个月。采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS)对JTHD进行分析。ELISA法检测血管内皮细胞生长的变化血清中VEGF和脂蛋白a的含量。采用EVG染色观察病理变化血管。TUNEL法检测大鼠血管平滑肌细胞凋亡率(VSMCs)。采用Micro-CT和ImagePro Plus软件观察和计算弯曲指数;小鼠基底动脉血管的延长指数、血管直径增加百分比和弯曲度。

动物模型建立、分组及给药

造模参考了Day等人的方法，即通过小鼠小脑延髓池，用微量注射器缓慢刺入枕骨大孔，注射2.5μL含有25mu的弹性蛋白酶。14天内，因造模导致的死亡有5只小鼠。14天后，随机取5只造模小鼠，通过FlowTech MICROFIL血管造影剂进行造影，然后用解剖显微镜匹配的MicroPublisher 5.0 RTV的照相机拍摄血管网图像，并用校正的Q-Capture Pro 7软件进行捕获图像，视觉评估基底动脉弯曲、扩张情况，当小鼠基底动脉出现弯曲、延长、扩张时，表示造模成功。假手术组仅在小脑延髓池内注射含有灭活后的弹性蛋白酶的磷酸盐缓冲液2.5μL。

造模后小鼠分为模型组、阿托伐他汀钙片组、加味通窍活血汤低剂量组、加味通窍活血汤高剂量组（n=10）。其中，阿托伐他汀钙片组给予2.6mg·Kg·d-1阿托伐他汀钙片灌胃，加味通窍活血汤低、高剂量组分别给予含有3.4g生药材·Kg·d-1和17g生药材·Kg·d-1的加味通窍活血汤颗粒剂，假手术组和模型组给予等体积的纯水。小鼠给加味通窍活血汤的剂量是基于临床上60kg体重的人每天服原药材计算。

小鼠离体基底动脉形态的微CT断层扫描

采用FlowTech MICROFIL血管造影剂进行造影，固定24h后，剥离脑组织。应用VENUS（平生医疗科技有限公司，型号：VNC-102）对小鼠离体脑组织进行了测量和分析。参数为：分辨率14μm，电压和电流分别是90kV和0.06mA。CT扫描后，用Avatar软件重建小鼠离体脑组织的图像。然后使用分割功能，定义CT值大于500的范围为血管区域，CT值大于-200以上范围为整个小鼠脑组织区域。对指定的血管区域进行裁剪，擦除和该血管相连的其他血管区域，保留指定血管区域。

实验结果

对基底动脉血管显微结构的影响

与假手术组相比，模型组小鼠的基底动脉明显迂曲、延长和扩张，（图6，7），而假手术组未见明显的变化（P＜0.01）。与模型组相比，加味通窍活血汤干预2个月后，能够显著抑制颅内基底动脉的迂曲、延长和扩张（图6，7）（P＜0.05，P＜0.01）。

图6 小鼠颅内动脉血管的代表性三维图像（n=4）

实验结论

综上所述，研究通过小脑延髓池注射弹性蛋白酶的方法，构建了BAD小鼠模型，并鉴定出加味通窍活血汤含有多种抗血管炎症反应和血管重塑的有效化合物成分。然后观察加味通窍活血汤的干预作用，发现其具有良好的抗基底动脉血管延长、迂曲、扩张作用，其机制可能与下调YAP/TAZ信号通路，抑制血管平滑肌细胞凋亡有关。

使用设备

                                                     Micro CT（型号：VENUS）（平生医疗科技）

                                                             影像软件：Avatar（平生医疗科技）