文献信息

华北理工大学公共卫生学院、华北理工大学中医药学院、国家卫生健康委员会尘肺病重点实验室等单位的研究成果《Paeoniflorin mitigates MMP-12 inflammation in silicosis via Yang-Yin-Qing-Fei Decoction in murine models》（芍药苷通过养阴清肺汤减轻小鼠矽肺MMP-12炎症）在杂志《Phytomedicine》（IF：6.7）上发表。平生公司的离活一体CT（NEMO）在论文中提供了小鼠肺部图像和定量分析。

该研究的通讯作者为徐丁洁；第一作者是李田。

文献摘要

背景:矽肺带来了重大的临床挑战和经济负担，中医(TCM)正在成为潜在的治疗途径。然而，中医治疗矽肺的确切效果和机制仍不确定，并存在争议。

目的:研究养阴清肺汤及其关键成分芍药苷对矽肺的治疗作用及其机制。

方法:用YYQFD、吡非尼酮(PFD)或芍药苷治疗硅小鼠。用二氧化硅、基质金属蛋白酶-12 (MMP-12)或TGF-β1刺激RAW264.7细胞和小鼠肺成纤维细胞(MLF)，然后用芍药苷、PFD或相关抑制剂处理。采用高效液相色谱(HPLC)对YYQFD的成分进行了表征。通过组织病理学检查、显微ct成像、肺功能和Western blot分析评估肺纤维化严重程度。通过转录组测序和生物信息学分析，研究了YYQFD在矽肺中调控的基因表达谱和靶基因。

结果:YYQFD治疗可改善二氧化硅导致的肺纤维化。转录组测序鉴定MMP-12是YYQFD和PFD的潜在共同靶点。此外，研究还揭示了MMP-12在二氧化硅诱导的巨噬细胞中的潜在促炎作用。芍药苷是YYQFD中最具特色的化合物之一，它通过直接结合作用减弱了二氧化硅诱导的巨噬细胞中MMP-12的增加及其衍生的炎症因子。值得注意的是，芍药苷通过抑制二氧化硅暴露小鼠的MMP-12衍生炎症因子和TGF-β1诱导的肌成纤维细胞分化发挥抗纤维化作用。

结论:本研究强调芍药苷是YYQFD中最主要的生物活性化合物之一，强调其在体内和体外均具有减轻巨噬细胞来源的MMP-12驱动的肺部炎症和减少肺纤维化的能力。

实验方法

YYQFD制备

YYQFD按照2015年版《中国药典》指导原则配制而成。加入体积为8倍(v/w)的超纯水浸泡30分钟，煮沸2小时提取汤剂。随后，将淡水加入到草药混合物中，并将其再煮沸一小时以获得第二次汤剂。两种煎剂混合，通过八层纱布过滤。滤液用超纯水稀释至终体积为500 ml，对应原药浓度为0.086 g/ml。在之前的临床研究中使用的剂量为2.19 g/kg，随后的实验将其转换为约20 g/kg。采用超高效液相色谱-高分辨率质谱法(UHPLC-HRMS)对YYQFD的主要成分进行鉴定。

小鼠模型建立

8周龄雄性C57BL/6 J小鼠在华北理工大学动物实验中心的特定无病原体(SPF)环境中饲养。如前所述，通过支气管输注10mg二氧化硅悬浮液构建矽肺小鼠模型。70只小鼠随机分为5组(每组10只):(1)对照组:0.9%生理盐水;(2)矽肺病组:二氧化硅暴露;(3) YYQFD低剂量治疗组:暴露二氧化硅14天后，灌胃20 g/kg YYQFD 14天;(4) YYQFD高剂量处理组:二氧化硅暴露加40g /kg YYQFD;(5)阳性对照组(PFD) :二氧化硅暴露加200 mg/100 μl PFD 灌胃。(6)芍药苷低剂量组:二氧化硅暴露加芍药苷50 mg/kg;(7)芍药苷高剂量组:二氧化硅暴露加100 mg/kg芍药苷。

Micro CT分析

使用NEMO（NMC-200）微型CT仪(平生医疗科技有限公司)获得活体小鼠肺部的CT图像。将小鼠置于俯卧位，使用Cruiser软件采集数据，使用Recon软件离线重建数据，使用Avatar分析数据并重建肺部结构。

实验结果

如图1A所示，YYQFD低剂量、YYQFD高剂量和PFD治疗组的矽肺病变和胶原沉积显著减少。Micro-CT分析进一步显示，与矽肺组相比，YYQFD和PFD治疗组的高密度体积百分比下降(图1B)。此外，对肌成纤维细胞标志物Desmin的免疫荧光检测显示，在YYQFD(低剂量和高剂量)组中，Desmin的阳性表达显著降低(图2A)。此外，纤维化标志物，包括Col I、Fn1、α-SMA和PAI-1，在YYQFD(低剂量和高剂量)以及PFD治疗组中均表现出下调(图2B)。

图1  YYQFD减轻硅小鼠胶原沉积。(B) CT成像:冠状面、横切面、垂直平面成像使我们能够看到肺部的结构变化。三维重建提供了肺部结构的全面视图。数据以mean±SD表示，每组n = 3。C:控制;S:矽肺病;Y-l: YYQF-LOW;Y-H: YYQF-HIGH;PFD: Pirfenidone。

此外，在巨噬细胞耗竭模型中，观察到MMP-12和其他纤维化标志物的下调，以及肺纤维化的减少(图5A和B)。TLR4抑制剂(TLR4- c34)治疗降低了二氧化硅诱导的RAW 264.7细胞中的MMP-12水平(图5C)。此外，MMP-12抑制剂还能减弱二氧化硅诱导的RAW 264.7细胞中炎症标志物(如TNF-α、IL-6、IL-1β和IL- 17A)的升高(图5D)。结果提示MMP-12可能通过二氧化硅诱导的TLR4信号通路调控促炎作用。

图5 巨噬细胞来源的MMP-12在肺中的作用。(A)各组肺组织显微CT图像及相应的H.E.图像。

为了研究芍药苷的抗纤维化作用，采用矽肺小鼠进行实验。如图9所示，芍药苷治疗导致矽肺病变、胶原沉积和肺功能受损的减少。芍药苷处理也导致矽结节内肌成纤维细胞减少(图10A)，纤维化标志物包括Col I、Fn1、α-SMA和PAI-1水平降低(图10B)。

图9 芍药苷减轻矽肺小鼠小鼠胶原沉积。(B)小鼠CT成像的冠状面、横切面、垂直面及三维拟合图像。数据以mean±SD表示，每组n = 3。C:控制;S:矽肺病;PF-l:矽肺+ Paeoniflorin-Low;PF-H:矽肺+ Paeoniflorin-High。

文献结论

总的来说，本研究揭示了YYQFD的药理作用、潜在途径和活性成分。作者的研究结果强调了YYQFD及其成分芍药苷在减轻二氧化硅暴露小鼠肺纤维化方面的治疗前景。

此外，作者已经揭示了二氧化硅诱导的MMP- 12的产生可以作为肺部炎症的驱动因导致肺纤维化的级联反应。重要的是，作者的研究结果表明YYQFD和芍药苷可以逆转矽肺病中MMP-12引起的炎症，为进一步探索提供了潜在的治疗途径。

使用设备

                                  Micro CT (型号：NEMO) (平生医疗科技)

                                          影像软件：Avatar（平生医疗科技）