文献信息

北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所，核医学科，国家药监局放射性药物研究与评价重点实验室，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室的研究成果Construction of [⁸⁹Zr]Zr-Labeled HuL13 for ImmunoPET Imaging of LAG‑3 Checkpoint Expression on Tumor-Infiltrating T Cells（[⁸⁹Zr] zr标记的HuL13用于肿瘤浸润性T细胞LAG‑3检查点表达的免疫PET成像的构建）在学术期刊《MOLECULAR PHARMACEUTICS》发表。平生公司的小动物PET/CT（型号：Super Nova）产品在论文中提供了重要的肿瘤小鼠PET/CT图像和定量分析。

该研究的通讯作者为北肿杨志主任，朱华研究员。第一作者为丁立新。

文献背景

摘要:淋巴细胞活化基因3 (LAG-3)作为一种具有潜在价值的免疫检查点受到了广泛关注。在筛查和治疗过程中对LAG-3表达的个体鉴定可以提高抗LAG-3治疗的成功实施。HuL13是一种人IgG1单克隆抗体，可与T细胞中的LAG-3受体结合。在这里，作者使用[⁸⁹Zr] ZR标记的HuL13通过正电子发射断层扫描(PET)成像来描绘LAG-3+t细胞浸润肿瘤。通过慢病毒感染获得了稳定表达LAG-3的A549/LAG-3细胞。各时间点A549/LAG-3细胞对[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13的摄取均大于阴性对照(A549/NC)细胞。[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13对LAG-3受体的平衡解离常数(Kd)为8.22 nM。PET成像显示，注射后24小时，A549/LAG-3荷瘤小鼠肿瘤区域有明显摄取(24小时时SUVmax=2.43±0.06)。作为概念证明，作者在MC38荷瘤人源化LAG-3小鼠模型中进一步研究了[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13示踪剂的PET成像。PET显像显示[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13示踪剂特异性靶向肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)上表达的人LAG-3。除肿瘤外，脾脏也明显可见。肿瘤对[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13示踪剂的摄取低于其在脾脏中的摄取，但通过联合注射未标记抗体可以降低其在脾脏中的高摄取。未标记抗体的共注射增加了血液池中示踪剂的活性，从而改善了肿瘤的摄取。健康小鼠模型的剂量学评价显示，脾脏吸收辐射剂量最高，其次是肝脏和心脏壁。综上所述，这些研究证明了使用[89Zr]Zr-DFO-HuL13示踪剂检测TILs上LAG3表达的可行性。[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13示踪物的进一步临床评价可能对适合抗LAG-3治疗的患者的分层和管理有重要帮助。

实验方法

动物模型建立

BALB/c裸鼠(雌性，5~6周龄)和KM小鼠(雌性，20g体重)。B6-hLAG-3小鼠(雌性，5-6周龄)，人源化LAG-3敲入小鼠。将A549/LAG3细胞(100μLPBS为5×10⁶)或A549/NC细胞(100μL PBS为5×10⁶)皮下接种于裸鼠右肩。将MC38细胞(1×10⁶/100μLPBS)皮下注射至B6hLAG-3小鼠右肩，建立荷瘤hLAG-3(MC38/hLAG-3)小鼠模型。当肿瘤大小达到100~300mm3时，进行PET成像。

PET成像与生物分布研究

用异氟醚麻醉荷瘤小鼠(n=3)，并静脉注射[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13 (3.7MBq/200μL PBS)。在注射后2、24、48、72和96h使用小动物PET扫描仪(Super Nova PET/CT, PINGSENG, Shanghai, China)进行PET成像。[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13的特异性通过以60:1的摩尔比共注射未标记抗体在载瘤hLAG-3小鼠模型中进行评估。使用有序子集期望最大化(OSEM)重建PET图像，并使用Avatar软件(平生医疗科技有限公司)进一步分析。在器官和肿瘤组织中绘制感兴趣区域(ROI)，并使用最大标准化摄取值(SUVmax)来量化示踪剂的摄取。PET显像后，处死小鼠，收集主要脏器和肿瘤，称重，用γ-计数器测定放射性。结果以% ID/g表示。

实验结果

[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13在A549/LAG3和A549/NC肿瘤模型中的PET成像为了证明[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13在体内的特异性，作者使用携带高水平稳定表达LAG-3的A549/LAG-3肿瘤和A549/NC肿瘤的BALB/c裸鼠作为对照。A549/LAG-3和A549/NC肿瘤模型的代表性微PET/CT图像(注射后2、24、48、72和96h)如图3A所示。根据ROI的划定和量化，注射后各选择时间，A549/LAG-3荷瘤小鼠肿瘤区域的SUVmax明显高于对照A549/NC荷瘤小鼠(图3B)。[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13示踪剂在A549/LAG-3荷瘤小鼠的肿瘤区域连续积累96h(2h时SUVmax值为1.13 ± 0.05; 24h时2.43 ± 0.06; 48h时3.89 ± 0.04; 72h时4.61 ± 0.04; 4.92 ± 0.06(96h))，但在A549/NC荷瘤小鼠的肿瘤区域没有(图3B)。

图3.[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13在A549/LAG-3和A549/NC肿瘤模型中的作用(A)注射[⁸⁹Zr] Zr-DFOS-HUL13示踪剂(3.7MBq/200μL)后2、24、48、72和96 h在A549/LAG-3和A549/NC肿瘤模型中具有代表性的微PET/CT图像。白色圆圈显示的区域表示肿瘤。(B) A组影像中肿瘤感兴趣区域(ROI)量化(n=3)。

[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13在MC38荷瘤人源化LAG-3小鼠模型中的PET成像为了证明这一概念，作者描述了[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13在正常和A549/ LAG-3荷瘤小鼠中的PET成像和生物分布。将106个MC38细胞接种到人源化LAG-3小鼠体内，产生肿瘤浸润淋巴细胞。因此，作者采用MC38/hLAG-3小鼠模型来评价[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13示踪剂对肿瘤浸润淋巴细胞的显像效果。MC38/hLAG-3小鼠模型的代表性微PET/CT图像(注射后2、24、48、72和96 h)如图4A所示。PET/CT成像显示[⁸⁹Zr]ZrDFO-HuL13在肿瘤中摄取，但也在健康组织(如脾脏)中摄取，这与脾脏致密的淋巴组织组成相一致。各器官的SUVmax为通过从PET图像中勾画ROI来确定。在该模型中，肿瘤区域的SUVmax在24h时达到最大值3.22±0.09,96h时逐渐降低至1.22±0.07，而脾脏的SUVmax在72 h内继续升高，在72h时达到最大值11.66±0.27(图4B)。在共注射过量未标记HuL13的阻断组中，肿瘤和脾脏的摄取被阻断(24h时SUVmax值为1.84±0.06 vs 3.22±0.09,P<0.001)，证实了示踪剂对TILs上表达的LAG-3的特异性(图4C)。