客户论文发表 | 放血对低压缺氧所致幼鼠骨退化的治疗作用
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文献信息

西藏自治区人民政府驻成都办事处医院生物样本库、青海大学高原医学研究中心等的研究成果《Therapeutic effect of bloodletting on bone deterioration induced by hypobaric hypoxia in young rats》(放血对低压缺氧所致幼鼠骨退化的治疗作用)在期刊《Bone》上发表。平生公司的离活一体CT(NEMO)在论文中提供了重要的大鼠股骨图像和定量分析结果。

 

该论文的通讯作者为汤峰,邬云红,第一作者为郝豆豆。

 

 

文献摘要

目的:高海拔地区,包括缺氧条件,与不同的海拔引起的病理有关,包括骨密度降低。阐明这种环境下骨退化的机制和开发有针对性的干预和治疗方法是很重要的。放血疗法具有良好的临床应用前景,但其对骨骼系统和骨稳态的影响尚不清楚。本研究旨在探讨低压缺氧环境对幼年SD大鼠特定股骨形态和结构特性的影响,包括骨体积、皮质厚度和小梁微结构,并探讨放血干预对这些参数的潜在调节作用。

 

方法:6周龄雄性SD大鼠,模拟5000-m海拔的低气压缺氧环境,持续12周。放血干预组大鼠每周尾静脉抽血500 μL。采用Micro-CT技术、苏木精和伊红染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色综合评价股骨微结构、组织结构和细胞形态。此外,通过免疫荧光分析来量化关键蛋白的表达,并通过转录组分析来鉴定差异表达基因。

 

结果:暴露在低氧环境下的大鼠骨矿物质含量、骨小梁数量和骨皮质厚度明显减少,表明骨微结构恶化。此外,缺氧环境上调RANKL和HIF-1α的表达,下调RUNX2的表达。值得注意的是,尽管放血干预并没有显著逆转这些骨结构变化,但转录组分析揭示了放血干预对关键基因表达的调节作用,尤其是Mmp2、Fosl2和URS0000B2A65A,这些基因与缺氧反应、破骨细胞分化和PI3K-Akt信号通路有关。

 

结论:本研究强调了低压缺氧对幼年大鼠骨骼微观结构的不利影响,并强调了放血改善这种情况的治疗潜力。此外,对放血对基因表达影响的调控机制的研究为骨改变提供了新的视角。它为开发新的预防措施和靶向治疗方法提供了有希望的途径,以解决相关骨疾病带来的挑战。

 

实验方法

动物准备

选用雄性无特定病原体级SD大鼠30只,4-6周龄。在1周的适应性喂养期后,将大鼠随机分为正常对照组(NC)、低压缺氧组(HH)和低压缺氧放血组(HH- BL),每组10只。对照组大鼠饲养在青海大学动物饲养设施(海拔2261 m), HH组和HH- BL组大鼠饲养在模拟海拔5000 m(大气压力54 kPa)的9000 × 3200 × 3200 mm的低压缺氧舱中所有大鼠维持12小时的光照/黑暗周期,并给予标准颗粒饲料(由中国北京高协和饲料有限公司提供)和随意饮水。动物室温和湿度分别保持在20±2◦C和60±5%。HH组和HH- bl组大鼠连续置于低压缺氧舱12周,每周更换笼褥和设备。在换料和换料期间,海拔高度调整为3500 m(大气压64.9 kPa),其余时间保持5000 m的模拟海拔高度。HH-BL组大鼠每周尾静脉抽血500 μL,连续12周。

 

Micro CT扫描

安乐死后,取大鼠左股骨标本,快速浸泡在含有0.1 M磷酸钠(pH 7.0)的4%多聚甲醛固定液中,以确保保存标本的原始形态和结构完整性。为了进一步探索股骨的微结构,作者采用了高分辨率Micro CT技术(NEMO,NMC-100,平生医疗科技有限公司)。在扫描过程中,样品被放置在X射线源和高性能CMOS探测器之间。样本在扫描区域内沿其垂直长轴进行了360度旋转,总共进行了4000次精确的投影。具体扫描参数设置为:电压90 kV,电流0.06 mA。扫描完成后,作者利用Avatar v1.6.9.3软件(平生医疗科技有限公司)对采集到的数据进行了深入的三维重建和综合分析。作者选择感兴趣区域(ROI)来评估股骨的微观特征,如下所示:首先,关注位于距股骨干骺端生长板1.5 mm处的2 mm高的骨小梁区域;其次,对距离生长板10 mm的2 mm长的皮质骨段进行分析,得到皮质骨厚度、骨矿物质含量、骨小梁体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁间距等关键指标数据。

 

实验结果

为了评估慢性低氧对大鼠股骨微结构的影响和放血治疗的潜在作用,作者对大鼠股骨微结构进行了详细的分析。基于Micro CT,在ROI中检查股骨干骺端和皮质骨(图2A -  B),三维图像显示冠状面、矢状面和轴向面(图2C - F)。Micro CT分析显示,低气压缺氧组皮质骨量显著减少,表现为皮质厚度、骨矿物质含量和皮质骨体积减少。然而,放血治疗并没有显著改善低气压缺氧大鼠的皮质骨结构(图2g - 1)。胫骨生物力学测试显示,在12周的低气压缺氧后,最大骨折力下降,表明骨力学性能降低,而放血治疗倾向于改善这一点(图2J)。在股骨小梁骨中,低气压缺氧组表现出明显的骨丢失,骨小梁分离增加,骨矿物质含量、骨小梁体积分数和骨小梁数量减少,但骨小梁厚度无明显变化。虽然放血治疗导致骨小梁结构有所改善,但骨微结构参数的变化无统计学意义(图3e - 1)。这些发现为慢性低压缺氧对骨骼系统的影响和放血的潜在治疗效果提供了有价值的见解。

 

 

图2所示。低氧缺氧对年轻雄性SD大鼠皮质骨退化的影响及放血治疗的潜在缓解作用。(A-B) 分析骨骼微观结构的兴趣体积(VOI)选择的描述,其中粉红色表示小梁骨,蓝色表示皮质骨。(C-F)在冠状面、矢状面和轴向面显示股骨干骺端骨微观结构和皮质骨结构的代表性三维图像。(G-I)皮质骨显微结构参数的定量分析,包括皮质厚度(Ct.Th)、皮质骨矿物质含量(Ct.BMC)、皮质骨体积(Ct.BV)。(J)生物力学分析揭示胫骨骨折的极限破坏载荷(UFL)。实验采用正常对照组(NC)和低氧放血组(HH- bl)各10只大鼠和低氧放血组(HH)各9只大鼠。所有数据均以均数±标准差表示,采用Bonferroni校正的单因素方差分析评估统计显著性。* p < 0.01;** p < 0.0001。

 

使用结论

综上所述,放血治疗对大鼠无不良影响,且未对本研究测量的任何骨参数产生明显改变。然而,在骨髓细胞和干骺端骨组织的表达模式中发现的关键基因的功能验证,受低压缺氧和放血治疗的调节,尚未在体外进行,这是研究的关键下一步。然而,这一研究结果有望为预防和治疗因低气压缺氧所引发的骨疾病的提供新策略。

 

使用设备

 

 

                                  Micro CT (型号:NEMO) (平生医疗科技)

                                          影像软件:Avatar(平生医疗科技)